In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Durante lo sviluppo embrionale, dei tessuti e degli organi morfogenesi avvengono attraverso un programma preciso che può essere descritto in termini di proliferazione cellulare, la migrazione delle cellule e le specifiche lignaggio 1-4. Questi processi biologici sono anche coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi tessuti adulti, che richiede la rigenerazione delle cellule staminali. Lineage tracing, l'identificazione e il monitoraggio della progenie di un tipo specifico di popolazione di cellule, fornisce un importante strumento per lo studio embriogenesi e staminali omeostasi cellulare. Infatti, è sempre più utilizzato in molti settori della ricerca. In particolare, il lignaggio tracciato è diventato uno strumento essenziale per identificare l'origine e il destino delle cellule staminali in omeostasi e sviluppo del cancro. Questo è perché può fornire informazioni essenziali su come la cella si comporta nel contesto del tessuto intatto o organismo, con il minimo intervento sperimentale, in contrasto con l'isolamento delle cellule e in coltura o transplantati vitroil che può provocare distorsioni indesiderate.
Tradizionalmente, i coloranti, come liposolubile carbocyanine, che incorporano nella membrana plasmatica delle cellule, sono stati utilizzati per lignaggio tracciamento. Sebbene questi tipi di esperimenti hanno portato con successo a importanti scoperte e concetti seminali sagomati in biologia dello sviluppo 5,6, hanno alcune limitazioni, tra cui la difficoltà di controllare la specificità di cellule bersaglio, l'impatto indesiderato del colorante sul comportamento delle cellule e la diluizione dell'etichetta nel tempo. Approcci di etichettatura analogo nucleotidico hanno permesso che documenta l'esistenza di slow-cycling "label mantenendo celle" che presumibilmente corrispondono a cellule staminali quiescenti 7,8. Tuttavia, mentre questa tecnica può dimostrare la presenza di cellule proliferanti lenti basati sulla cinetica di proliferazione in un periodo di tempo limitato non potrebbe fornire indicazioni sostanziali sulla funzionalità delle cellule staminali. Un ottimale meth lineage tracingmeto- dovrebbe minimizzare l'effetto dell'etichettatura sulle proprietà della cella sensibile, la sua progenie o suoi vicini. Inoltre, sarebbe utile avere controllo sull'induzione etichettatura, cioè, avere la possibilità di codificare la popolazione di cellule in una fase e modo dipendente tempo così come in una singola cella (clonale) modo. Un metodo di etichettatura stabile ed irreversibile che viene trasmesso a tutta la progenie della cellula fondatore è importante in modo che l'etichetta sarebbe mantenuta nel tempo, e non trasferito in cellule vicine.
Più di recente, sono stati sviluppati approcci genetici di marcatura delle cellule. In questi sistemi, promotori specifici cellulari possono essere utilizzati per attivare l'espressione ricombinasi Cre per rimuovere un blocco stradale loxP-fiancheggiato e permettere l'espressione di geni reporter come proteina fluorescente verde o Β-galattosidasi geni reporter 9-13. Questo approccio permette non solo il monitoraggio delle cellule e la loro progenie, ma permette anche di cella èolation e caratterizzazione molecolare. Inseguimento cellulare a livello di singola cellula diventato possibile per induzione dell'espressione di un singolo gene reporter fluorescente. Una importante limitazione di questo sistema è il fatto che solo quando molto bassa percentuale di cellule è etichettato è possibile separare e tracciare singoli cloni. Per superare questa limitazione giornalisti multicolori possono essere utilizzati. Quando si utilizza l'etichettatura multicolore, il monitoraggio del destino differenziale di cellule vicine nella stessa nicchia può essere raggiunto in modo efficiente 14-17. Recentemente, una varietà di Brainbow (Br) alleli sono stati sviluppati per lineage tracing esperimenti, consentendo una espressione stocastico di molteplici geni reporter fluorescenti che utilizzano il sistema Cre / lox. Il sistema Cre / lox costituito dalla ricombinasi enzima Cre, che riconosce e si lega a specifiche sequenze di DNA come i siti loxP. In seguito al legame di Cre ricombinasi, si verifica la ricombinazione sito specifico, che provoca la rimozione di loxP affiancato sequenze resulting nell'espressione casuale di proteine fluorescenti differenti (il meccanismo è descritto di seguito). Una varietà di linee Br sono disponibili per l'uso (vedi recensioni 16,18,19). Le principali differenze tra i ceppi Br includono (i) differenze nel numero di geni fluorescenti inclusi nella cassetta, che vanno dal 2 (Br 2.0), 3 (Br1.0) a 4 (Br1.1, Br2.1) geni fluorescenti , (ii) la presenza di siti lox reciprocamente orientati per consentire l'inversione gene (Br2.0-2.1), (iii) il tipo di siti lox utilizzati, e (iv) l'espressione o il silenzio dell'espressione genica fluorescenti prima dell'attivazione Cre. BR3 recentemente costituito offre un metodo perfezionato per l'imaging di neuroni multicolore. Una delle caratteristiche principali di questa trascrizione è che contiene un nuovo insieme di proteine fotostabili farnesylated fluorescenti, che permettono anche una colorazione dei migliori neuronale processi 20.
È importante sottolineare che diverse versioni di cassette Br possono contenere la specifica neuronale Thy1 promoter o il ubiquitariamente espresso CAG (CMV) promotore. Infine, mentre alcuni dei topi transgenici Br può contenere un singolo transgene Br, altri possono consistere di più copie del transgene, consentendo in tal modo la produzione di un numero immenso di possibilità di combinazioni cromatiche essere espresso in ciascuna cella (per esempio vedi 16).
Nel nostro studio, abbiamo usato il mouse R26R-coriandoli, che contiene la cassetta 21 Fr. 2.1. Br2.1 è unicamente progettato per consentire inversioni DNA Cre-mediati e non solo escissioni causa dell'orientamento reciproco dei siti loxP (Figura 1). Così, questi eventi di inversione / escissione che portano al cambiamento di colore possono continuare fino a quando è presente 16 Cre. Per questo motivo, un temporale sistema di espressione inducibile Cre è essenziale per il monitoraggio delle cellule affidabile utilizzando Br2.1. Come mostrato in figura. 1, il Br2.1 contiene un promotore CAG onnipresente seguito da loxP-fiancheggiato Neo R -cassette, che agisce come un posto di blocco trascrizionale, che è seguito da 4 geni fluorescenti giornalista, codifica per il verde (GFP), giallo (YFP), rosso (RFP) e ciano (PCP) proteine fluorescenti, posizionati in due tandem. Nessuna fluorescenza si esprime prima dell'attivazione Cre. Induzione di ricombinasi Cre provoca la rimozione della cassetta Neo-R consente l'espressione casuale di una delle proteine fluorescenti 4 in una data cellula. Il primo segmento contiene GFP loxP-fiancheggiato e YFP invertita, mentre il secondo segmento contiene RFP loxP-fiancheggiato e CFP invertita. Questi segmenti di DNA possono essere invertiti in continuo (con loxP che sia in orientamento inverso), o asportato, purché Cre ricombinasi è presente. Pertanto, deve essere utilizzato un transgene Cre transitoria e controllato. La cassetta Br2.1 fornisce un ottimo sistema per distinguere tra le emissioni che si sovrappongono su di posizione del segnale: l'espressione di YFP e RFP è citoplasmatica, la GFP è nucleare e la PCP è legato alla membrana cellulare. GFPe le emissioni di RFP sono facilmente separati da microscopia a fluorescenza convenzionali. Al fine di separare le emissioni di YFP / GFP / CFP, è necessario un sistema di imaging confocale spettrale. Complessivamente, la cassetta Br2.1 permette casuale, inducibile, e il tessuto specifica espressione di uno su quattro geni fluorescenti distinti in ogni cella di destinazione. Infatti, quando è necessario un maggior numero di combinazioni di colori, è possibile generare topi omozigoti che contengono 2 alleli di Br2.1, conseguente espressione di 2 tag colore per ogni cella e aumentare il numero delle possibili combinazioni di colori a 10 22. Alcuni ceppi di topi Br consentono l'espressione di un numero molto maggiore di possibili combinazioni di colori dal più copie della cassetta sono stati integrati nel loro genoma 16. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, le quattro combinazioni di colori forniti da un singolo allele Br2.1 sono sufficienti. Seguendo il protocollo fornito qui, si può stabilire questo metodo che utilizza un relativamente semplice messa a punto di spectrAl microscopio con poca o nessuna necessità di calibrazione.
Qui forniamo un protocollo adattabile per l'uso dei topi R26R-Confetti che contengono un singolo allele Br2.1, per lineage tracing esperimenti dell'epitelio corneale. Questo ceppo di topo transgenico è stato utilizzato per studiare l'origine e il destino dei due punti 21,23 e le cellule staminali epiteliali corneali 22,24, la presenza di attività delle cellule staminali nel cancro intestinale 25, e per la caratterizzazione podocita rene in glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS) 17.
Sono stati condotti esperimenti lineage tracing per molti anni. I recenti miglioramenti tecnologici e l'emergere di ceppi di topi Confetti hanno aperto nuove strade per la ricerca. Oggi, i ricercatori possono beneficiare di un gran numero di linee disponibili in commercio Cre tessuto-specifici, topi knockout e topi transgenici. Questo offre l'opportunità per la progettazione di sistemi versatili sperimentali per affrontare questioni scientifiche con competenze di base, evitando la pratica laboriosa, fornendo i dati robuste e affidabili.
Topi R26R-Confetti sono uno strumento elegante per il monitoraggio efficiente e studiare la natura e il comportamento di cellule in un organismo vivente. Il sistema è facile da stabilire e permette non invasivo lineage tracing di singole cellule durante l'embriogenesi, la rigenerazione delle cellule staminali sotto l'omeostasi, o in circostanze diverse, come lesioni, infiammazione e cancro. I dati ottenibili fornisce una robusta descriptione della sopravvivenza delle cellule bersaglio, espansione clonale delle cellule e la migrazione delle cellule, in modo quantificabile. Un passo fondamentale sarebbe quello di scegliere il ceppo di topi genetica appropriata che può permettere in modo affidabile un'etichettatura specifica tessuto efficiente in fase di sviluppo preciso. Una limitazione di questo sistema è che per il monitoraggio di un organismo vivente, il tessuto deve essere accessibile e trasparente. Allo stesso modo, il monitoraggio di un tessuto spesso all'interno di un animale vivente può essere facilitata solo da due fotoni o la microscopia multi-fotone. Tuttavia, il monitoraggio delle cellule è possibile in sezioni di tessuto post mortem e forse il tessuto intatto può essere studiato dopo che è stato trasformato per diventare trasparente dal metodo CLARITY 32,33. Un'altra limitazione è da considerare che, sebbene celle adiacenti che esprimono la stessa fluoroforo probabile appartengono alla stessa stirpe clonale, è anche possibile che essi possono essere derivati da cellule di origine indipendente che esprime in modo casuale lo stesso gene fluorescente. Questo Possibility diventa molto improbabile quando si utilizzano più alleli Br per consentire numerose combinazioni di colore.
In futuro, combinando il sistema di Confetti con strumenti genetici disponibili (vale a dire, ad eliminazione diretta, i modelli knockin e topi transgenici) permetterà lo studio dei geni e delle loro mutazioni in materia di salute e patologia. Allo stesso modo, il lignaggio tracciando sotto diverse perturbazioni di sistema (ad esempio, nicchia staminale distruzione, laser mediata l'ablazione delle cellule, il trattamento farmacologico) porterà nuove conoscenze sul coinvolgimento di vie di segnalazione nelle decisioni destino cellulare. In ultima analisi, l'uso combinatorio di etichettatura fluorescente e bioluminescenza, reporter genetici di vie di segnalazione e di taglio microscopia bordo fornirà ai ricercatori un sistema robusto per imparare come le cellule unico rispondere alle loro circostante nel loro ambiente nativo.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |