In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Embriyo gelişimi sırasında, doku ve organ morfogenez hücre proliferasyonu, hücre göçü ve soy tarifnamede 1-4 cinsinden tanımlanabilir kesin bir program sayesinde yer almaktadır. Bu biyolojik süreçler de hücre yenilenmesini kök gerektirir yetişkin doku homeostazını, muhafaza katılmaktadırlar. Lineage izleme, kimlik ve hücre popülasyonunun belirli bir tip soyu takibi, embriyojenezi okuyan ve hücre homeostazı kök için önemli bir araç sunmaktadır. Gerçekten de, giderek araştırmanın pek çok alanında kullanılmaktadır. Özellikle, soy izleme homeostasis ve kanser gelişiminde kökeni ve kök hücrelerin kaderini belirlemede önemli bir araç haline geldi. Hücre izolasyonu ve in vitro kültürü veya transplantati içinde aksine minimal deneysel müdahale ile hücre sağlam doku veya organizmanın bağlamında nasıl davranacağını hakkında önemli bilgiler sağlayabilir Bunun nedeniBu istenmeyen önyargı neden olabilir.
Geleneksel olarak, hücrelerin plazma zarına dahil, lipid çözünür karbosiyanin boya olarak, soy izleme için kullanıldı. Deneylerde bu tür başarılı gelişim biyolojisi 5,6 önemli keşifler ve şekilli seminal kavramlara yol açmıştır rağmen, hedeflenen hücrelerin özgünlüğünü kontrol etmek için zorluk, hücre davranışı üzerindeki boyanın istenmeyen etkisi ve seyreltme dahil bazı sınırlamalar var zaman etiketi. Nükleotid analog etiketleme yaklaşımları muhtemelen kök hücreleri 7,8 sakin koşullarda uygun "etiket istinat hücreler" yavaş bisiklet varlığını belgeleyen sağlamıştır. Bu tekniğin sınırlı bir süre boyunca çoğalma kinetiği dayalı yavaş bisiklet hücrelerinin varlığını göstermek olabilir Bununla birlikte, bu kök hücrelerin işlevselliğini ilgili önemli anlayışlar temin edemedik. Optimal soy izleme metduğu işaretli hücrenin kendi döl veya komşularının özelliklerine etiketleme etkisini en aza indirmek gerekir. Ayrıca, bir sahne ve zamana bağlı bir şekilde de yanı sıra tek bir hücre (klonal) şekilde ilgi hücre popülasyonu etiketlemek yeteneğine sahip, yani etiketleme indüksiyon kontrole sahip yararlı olacaktır. Etiket zamanla muhafaza ve komşu hücrelere transfer değil olacağını, böylece kurucu hücrenin tüm soyu aktarılır İstikrarlı ve geri dönüşümsüz etiketleme yöntemi çok önemlidir.
Daha yakın zamanlarda, hücre etiketleme genetik yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu sistemlerde, hücre spesifik promotörler, yeşil fluoresan protein ya da Β-galaktosidaz raportör genler gibi muhabir 9-13 genlerinin ifadesinin loxP-çevrili barikat çıkarın ve izin vermek için, Cre rekombinazın ifadesinin tetiklemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, sadece hücreler ve onların döl takibini mümkün kılan, aynı zamanda hücre izinolation ve moleküler karakterizasyonu. Tek hücre düzeyinde hücre takibi, tek bir floresan haberci genin ifadesinin indüksiyonu yoluyla mümkün hale geldi. Bu sistemin önemli bir sınırlama hücrelerinin çok düşük bir yüzde, ayrı ve tek tek klonlar izlemek mümkündür etiketli tek bir gerçektir. Renkli gazetecilere kullanılabilecek bu sınırlamayı aşmak için. Renkli etiketleme kullanırken, aynı niş komşu hücrelerin diferansiyel kaderin izleme verimli 14-17 elde edilebilir. Son zamanlarda, Brainbow (Br) alel çeşitli Cre / lox sistemi kullanılarak birden çok flüoresan raportör genlerin stokastik ifadesine imkan tanır, soy izleme deneyleri için geliştirilmiştir. Cre / lox sistemi algılar ve loxP sitelerinin gibi özel DNA dizilerine bağlanan Cre rekombinaz enzimin oluşur. Aşağıdaki Cre rekombinazın bağlanması site spesifik rekombinasyon oluşur loxP çıkarılması çevrili dizileri yolaçan neden olanFarklı floresan proteinleri rastgele ifadedeki g (mekanizması, aşağıda tarif edilmiştir) hazırlandı. Br hatlarının çeşitli (Değerlendirmeler 16,18,19 bakınız) kullanım için mevcuttur. Br suşları arasında büyük farklar 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) flüoresan genler arasında değişen, kaset dahil flüoresan genlerin sayısı (i) farklılıklar, , (ii) karşılıklı yönlendirilmiş lox mevkisi varlığı kullanılan lox mevkisi (iii) tipi, ve (iv) sentezleme veya floresan gen ekspresyonunun sessizlik önce Cre aktivasyonuna gen inversiyon (Br2.0-2.1) izin vermek. Yeni kurulan Br3 nöronların renkli görüntüleme için geliştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. Bu transkript ana özelliklerinden biri en iyi nöronal eşit bir boyama 20 süreçleri sağlayan ışığa farnesillenmiş floresan proteinleri, bir dizi yeni içermesidir.
Önemlisi, Br kasetlerinin farklı sürümleri Thy1 pr nöronal özgü içerebiliromoter veya ubiquitously CAG (CMV) promoteri dile getirdi. Br transgenik farelerin bazıları tek Br transgen içerebilirken Son olarak, diğerleri, böylece, her hücrede eksprese edilecek renk kombinasyonları olasılıklarının muazzam sayıda üretilmesini sağlayan, birden fazla transgen kopya içerebilir (örneğin 16).
Çalışmamızda, biz Br 2.1 kaset 21 içeren R26R-Konfeti fare kullanıldı. Br2.1 benzersiz Cre-aracılı DNA inversiyon nedeniyle loxP sitelerinin (Şekil 1) karşılıklı doğrultuda değil, sadece eksizyon izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Böylece, renk değişikliğine yol bu inversiyon / eksizyon olayları sürece Cre 16 mevcut olduğu gibi devam edebilirsiniz. Bu nedenle, bir indüklenebilir zamansal Cre sentezleme sistemi güvenilir hücre izleme Br2.1 kullanmak için gereklidir. Şekilde gösterildiği gibi,. 1, Br2.1 loxP-çevrili Neo R -casse ardından her yerde bulunan bir CAG promotörünü içerirbir transkripsiyon birlikte gösterim olarak hareket tte, iki tandem konumlandırılmış san bir yeşil için 4 flüoresan raportör genlerin kodlama (GFP), (YFP), kırmızı (RFP) ve mavi (CFP) floresan proteinleri takip eder. Resim floresans Cre aktivasyonu öncesinde ifade edilir. Cre rekombinazın indüksiyonu, belirli bir hücre içinde 4 floresan proteinleri bir rastgele ekspresyonunu sağlayan Neo-R kasetinin giderilmesini de sağlar. İkinci bölüm loxP-çevrili RFP ve ters CFP içerirken ilk parça, loxP-çevrili GFP ve ters YFP içerir. Bu DNA segmentleri sürekli sürece, Cre rekombinaz mevcut olduğu, (ters yönlenmede olduğunda loxP kullanılarak) ters veya çıkarılabilir. Bu nedenle, geçici ve kontrollü Cre transgen kullanılmalıdır. YFP ekspresyonunu ve RFP sitoplazmiktir, GFP, nükleer ve CFP hücre membranına bağlanır: Br2.1 kaseti sinyal konumuna bağlı örtüşen emisyonlar arasında ayırt etmeye yönelik mükemmel bir sistem sağlar. GFPve RFP emisyon kolayca geleneksel fluoresan mikroskobu ile ayrılır. YFP / GFP / CFP emisyon ayırmak amacıyla, bir spektral konfokal görüntüleme sistemi gereklidir. Toplamda, Br2.1 kaset hedeflenen her hücrede dört takım farklı floresan genlerin rastgele indüklenebilir ve doku spesifik ifadesini verir. Renk kombinasyonları daha büyük bir sayı gerektiğinde Aslında, bir bu şekilde her hücre için 2 renkli etiketleri sentezlenmesi ve 10 olası renk kombinasyonların sayısını artırmak sonuçlanan Br2.1 2 alellerini içeren homozigot fareler üretebilir Kasetin birden çok kopyası genomları 16 entegre çünkü 22. Br fare suşlarının bazı olası renk kombinasyonları çok daha büyük bir sayısının ifadesini mümkün kılar. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek bir Br2.1 alel tarafından temin edilen, dört renk kombinasyonları yeterlidir. Burada sağlanan protokol izlenerek, tek bir spectr nispeten basit bir düzeneği kullanılarak, bu yöntem kurabilirKalibrasyon için çok az, eğer herhangi bir ihtiyacı ile al mikroskopi.
Burada korneal epitelyumun soyu takip deneyler için, tek bir Br2.1 alel ihtiva R26R-Konfeti farelerin kullanım için uyarlanabilir bir protokol sağlar. Bu transgenik fare suşu kolon 21,23 ve kornea epitel kök hücrelerin 22,24 kökeni ve kaderi çalışmak için kullanılır olmuştur, ve fokal segmental glomerüloskleroz böbrek Podosit vasıflandırılması için bağırsak kanserine 25 kök hücre aktivitesinin varlığı (FSGS) 17.
Köken izleme deneyler yıllardır gerçekleştirilmiştir. Son teknolojik gelişmeler ve Confetti fare suşlarının ortaya çıkması araştırma için yeni yollar açtı. Günümüzde, ticari olarak temin edilebilen araştırmacılar dokuya-özgü Cre hatları nakavt fareler ve transjenik farelerin çok sayıda yararlanabilir. Bu sağlam ve güvenilir veri sağlarken, zahmetli uygulama kaçınarak, temel uzmanlık bilimsel sorulara yanıt için çok yönlü deneysel sistemler tasarlamak için bir fırsat sağlar.
R26R-Konfeti fareler verimli izleme ve canlı bir organizmada hücrelerin yapısını ve davranışlarını incelemek için şık bir araçtır. Sistem kurmak kolaydır ve, embriyogenez sırasında tek hücre non-invaziv soy izleme izin verir kök hücre yenilenmesini homeostazında altında, ya da yaralanma, enflamasyon ve kanser gibi farklı koşullarda. Elde veriler sağlam descript sağlarölçülebilir bir şekilde hedeflenen hücrelerin konumunun, klonal hücre genişlemesi ve hücre göçü hayatta kalma, iyonu. Bir kritik bir adım güvenilir bir kesin gelişim aşamasında etkin doku spesifik etiketleme izin verebilir uygun genetik fare zorlanma seçmek olacaktır. Bu sistemin bir sınırlama canlı bir organizmaya izlenmesi için, doku erişilebilir ve şeffaf olmasıdır. Benzer şekilde, bir canlı hayvan içinde kalın bir doku izlemenin yalnızca iki foton veya çoklu foton mikroskobu ile kolaylaştırılabilir. Ancak, hücre izleme postmortem doku bölümleri mevcuttur ve CLARITY yöntemiyle 32,33 ile şeffaf olmak dönüştürülmüştür sonra belki sağlam doku incelenebilir. Dikkate alınması gereken bir başka sınırlama, aynı fluorofor ifade komşu hücreler, büyük olasılıkla aynı klonal soy ait olsa da, bu rastgele kişi aynı flüoresan gen ifade bağımsız hücre kökenli türetilebilir da mümkündür olmasıdır. Bu possibiliÇok sayıda renk kombinasyonları izin birden Br allelleri kullanırken ty çok olası hale gelir.
Gelecekte, genlerin ve sağlık ve patoloji kendi mutasyonların çalışma izin verecektir mevcut genetik araçlar (yani, nakavt, knockin ve transgenik fare modelleri) ile Confetti sistemini birleştirerek. Aynı şekilde, soy hücre kaderinin kararları sinyal yolları katılımı üzerine yeni anlayışlar getirecektir farklı sistem pertürbasyonlar (yani, hücre yıkımını niş, lazer aracılı hücre ablasyon, ilaç tedavisi kök) kapsamında izleme. Sonuçta, floresan ve biyoışıldama etiketleme kombinasyon kullanımı, kenar mikroskopi sinyal yollarının ve kesme genetik gazetecilere araştırmacılara onların kendi doğal ortamında çevredeki nasıl tepki tek hücre öğrenmek için sağlam bir sistem sağlayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |