In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Während der Embryonalentwicklung, Gewebe- und Organ Morphogenese statt durch eine genaue Programm, das in Bezug auf die Zellproliferation, Zellmigration und Abstammungslinie Spezifikation 1-4 beschrieben werden kann. Diese biologischen Prozesse werden auch bei der Aufrechterhaltung der Erwachsenen Gewebehomöostase, die Stammzell-Regeneration erfordert beteiligt. Linienverfolgung, die Identifizierung und Verfolgung der Nachkommen einer bestimmten Art von Zellpopulation, stellt ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Embryogenese und Stammzellen Homöostase. Tatsächlich ist es in zunehmendem Maße in vielen Bereichen der Forschung eingesetzt. Insbesondere wurde Lineage Tracing ein wichtiges Instrument bei der Identifizierung der Herkunft und das Schicksal von Stammzellen in der Homöostase und der Entwicklung von Krebs. Dies liegt daran, dass es wesentliche Informationen, wie die Zelle im Kontext des intakten Gewebes oder Organismus verhält, mit minimalem experimentellen Eingriff zu schaffen, im Gegensatz zu Zellisolierung und in vitro-Kultur oder transplantatiauf, dass kann es zu ungewollten Verzerrung führen.
Traditionell Farbstoffe wie lipidlöslich Carbocyanin, die in die Plasmamembran von Zellen integrieren, wurden Linienverfolgung eingesetzt. Obwohl diese Arten von Experimenten wurden erfolgreich zu wichtigen Entdeckungen und geformt Samen Konzepte in der Entwicklungsbiologie 5,6 geführt, einige Einschränkungen auf, einschließlich der Schwierigkeit, die Spezifität der Zielzellen zu steuern, die unerwünschte Wirkung des Farbstoffs auf das Zellverhalten und dem Verdünnungs müssen sie des Etiketts über die Zeit. Nukleotidanalogon Kennzeichnung Ansätze aktiviert dokumentieren die Existenz von Slow-Cycling "Etiketthaltezellen", die vermutlich entsprechen Stammzellen 7,8 ruhenden. Obwohl diese Technik das Vorhandensein der langsamen zyklierenden Zellen basierend auf Proliferation Kinetik über einen begrenzten Zeitraum zeigen, konnte sie keine wesentliche Erkenntnisse über die Funktionalität von Stammzellen. Eine optimale Linie Tracing methdik sollte die Wirkung der Markierung auf die Eigenschaften der markierten Zelle seinen Nachkommen oder seinen Nachbarn zu minimieren. Zusätzlich wäre es vorteilhaft, um die Kontrolle über die Kennzeichnung Induktion haben, nämlich die Fähigkeit, die Zellpopulation in einem Stadium, und zeitabhängigen Art und Weise sowie in einer einzelnen Zelle (klonale) Weise zu markieren, zu haben. Eine stabile, irreversible Markierungsverfahren, die auf an alle Nachkommen des Gründerzelle übergeben wird, wichtig, so daß das Etikett im Lauf der Zeit zurückgehalten werden, und nicht auf Nachbarzellen übertragen.
In jüngerer Zeit genetische Ansätze der Markierung von Zellen entwickelt. In diesen Systemen können die zellspezifische Promotoren verwendet werden, wie beispielsweise grün fluoreszierendes Protein oder Β-Galactosidase Reportergene 9-13 zur Cre-Rekombinase-Expression um einen loxP-flankierten Hindernis beseitigt wird, sodass die Expression von Reportergenen auszulösen. Dieser Ansatz ermöglicht nicht nur die Verfolgung von Zellen und deren Nachkommen, sondern erlaubt auch ZelleBildung von Ol und molekulare Charakterisierung. Zellverfolgung in der Einzelzellebene wurde durch Induktion der Expression eines einzelnen fluoreszierenden Reportergens möglich ist. Eine wichtige Beschränkung dieses Systems ist die Tatsache, dass nur bei sehr geringen Prozentsatz an Zellen, markiert es möglich ist, zu trennen und Spuren individuelle Klone. Um diese Einschränkung zu multicolor Reporter verwendet werden überwunden. Bei Verwendung von Mehrfarben-Markierung kann das Tracking von Differential Schicksal von benachbarten Zellen in der gleichen Nische effizient 14-17 erreicht werden. In jüngster Zeit wurden eine Vielzahl von Brainbow (Br) Allele für Linienverfolgung Experimente entwickelt, so dass eine stochastische Expression multipler Fluoreszenzreportergene unter Verwendung des Cre / lox-System. Das Cre / lox-System besteht aus dem Enzym Cre-Rekombinase, erkennt und bindet an spezifische DNA-Sequenzen, wie loxP Sites. Im Anschluss an die Bindung von Cre-Rekombinase, ortsspezifische Rekombination stattfindet, die die Entfernung der loxP-Sequenzen flankiert resulting in zufälliger Ausdruck unterschiedlicher Fluoreszenzproteine (der Mechanismus wird unten beschrieben). Eine Vielzahl von Br Linien stehen zur Verfügung (siehe Bewertungen 16,18,19). Die Hauptunterschiede zwischen den Br Stämme umfassen (i) Unterschiede in der Anzahl der fluoreszierenden Gene in der Kassette enthalten ist, im Bereich von 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) bis 4 (Br1.1, Br2.1) Fluoreszenzgene , (ii) die Anwesenheit von wechselseitig orientiert lox-Stellen, um Gen-Inversion (Br2.0-2.1) zu ermöglichen, (iii) die Art der lox-Stellen verwendet wird, und (iv) der Ausdruck oder die Stille des fluoreszierenden Genexpression vor Cre-Aktivierung. Die kürzlich gegründete Br3 bietet ein verbessertes Verfahren zur Mehrfarben-Darstellung von Neuronen. Eines der wichtigsten Merkmale dieser Niederschrift ist, dass es einen neuen Satz von photo farnesyliert fluoreszierende Proteine, die eine gleichmäßige Färbung der schönsten neuronale Prozesse 20 ermöglichen, enthält.
Wichtig ist, kann verschiedene Versionen von Br Kassetten die neuronale spezifische enthalten Thy1 promoter oder ubiquitär exprimiert CAG (CMV) -Promotors. Schließlich, während einige der Br transgenen Mäusen kann eine einzige Br Transgen enthalten, andere können von mehreren Transgenkopien bestehen, wodurch die Produktion einer Unzahl von Möglichkeiten für die Farbkombinationen, die in jeder Zelle exprimiert werden (siehe zum Beispiel 16).
In unserer Studie haben wir die R26R-Confetti-Maus, die die Br 2,1 Kassette 21 enthält. Br2.1 ist einzigartig entworfen, um eine Cre-vermittelte DNA Inversionen und nicht nur Exzisionen wegen der gegenseitigen Orientierung der loxP-Stellen (Figur 1) zu ermöglichen. Somit können diese Inversion / Exzision Ereignisse, die Farbänderung führen, solange Cre vorliegenden 16 fortzusetzen. Aus diesem Grund ist ein zeitlicher induzierbaren Cre Expressionssystem Voraussetzungen für den sicheren Zellverfolgung mit Br2.1. Wie in Abbildung gezeigt. 1, die Br2.1 enthält eine allgegenwärtige CAG-Promotor, gefolgt von loxP-flankierten Neo R -cassette, das als Transkriptionsstraßensperre wirkt, wird dieser um 4 fluoreszierenden Reporter-Gene-Codierung für grün (GFP), Gelb (YFP), rot (RFP) und Cyan (GFP) fluoreszierende Proteine, in zwei Tandems positioniert gefolgt. Keine Fluoreszenz vor der Cre Aktivierung exprimiert. Induktion der Cre-Rekombinase bewirkt, dass die Entfernung des Neo-R-Kassetten ermöglicht die zufällige Expression von einem der 4 fluoreszierenden Proteinen in einer gegebenen Zelle. Das erste Segment enthält loxP-flankierten GFP und YFP umgekehrt, während das zweite Segment enthält loxP-flankierten RFP und GFP umgekehrt. Diese DNA-Segmente können kontinuierlich invertiert werden (unter Verwendung von loxP, die in umgekehrter Orientierung ist) oder herausgeschnitten, so lange wie Cre-Rekombinase anwesend ist. Daher sollte eine vorübergehende und kontrollierte Cre-Transgen verwendet werden. Die Br2.1 Kassette bietet ein ausgezeichnetes System für die Unterscheidung zwischen überlappenden Emissionssignal auf Standort: die Expression von YFP und RFP ist zytoplasmatisch, das GFP ist Kern- und die GFP an die Zellmembran gebunden. GFPund RFP Emissionen lassen sich leicht nach herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie getrennt. Um YFP / GFP / CFP Emissionen zu trennen, wird eine spektrale konfokale Abbildungssystem erforderlich. Insgesamt ermöglicht die Br2.1 Kassette die zufällige, induzierbare und Gewebe-spezifische Expression einer von vier unterschiedlichen fluoreszierenden Gene in der Zielzelle. In der Tat, wenn eine größere Anzahl von Farbkombinationen erforderlich ist, kann man homozygote Mäuse, die 2 Allele Br2.1 enthalten erzeugen, wodurch die Expression von 2 Farbmarkierungen für jede Zelle und bei der Erhöhung der Anzahl der möglichen Farbkombinationen zu 10 22. Einige der Br Mausstämmen zu ermöglichen, die Expression eines viel größeren Anzahl von Farbkombinationen möglich, da mehrere Kopien der Kassette wurden in ihr Genom 16 integriert. Doch in den meisten Fällen sind die vier Farbkombinationen durch eine einzige Br2.1 Allel bereitgestellt ausreichend. Nach dem Protokoll hier vorgesehen ist, kann man diese Methode mit einem relativ einfachen Aufbau spectr etablierenal Mikroskopie mit wenig oder gar keine Notwendigkeit für die Kalibrierung.
Hier stellen wir eine anpassbare Protokoll für die Verwendung der R26R-Konfetti-Mäusen, die eine einzelne Br2.1 Allel enthalten, Lineage Verfolgungsexperimente des Hornhautepithels. Diese transgenen Mausstamm wurde für die Untersuchung der Entstehung und das Schicksal von Dick 21,23 und Hornhautepithelzellen Stammzellen 22,24 verwendet wurde, die Gegenwart von Stammzellaktivität in Darmkrebs 25 und zur Charakterisierung von Nieren podocyte in Fokal segmentale Glomerulosklerose (FSGS) 17.
Linienverfolgungsexperimente sind seit vielen Jahren durchgeführt worden. Die jüngsten technologischen Verbesserungen und die Entstehung der Confetti Mausstämme eröffnet neue Wege für die Forschung. Heute können Forscher aus einer großen Anzahl von kommerziell verfügbaren gewebespezifische Cre Linien-Knockout-Mäusen und transgenen Mäusen profitieren. Dies bietet die Möglichkeit für die Gestaltung vielseitige experimentelle Systeme für die Bewältigung wissenschaftlicher Fragestellungen mit grundlegenden Know-how, die Vermeidung mühsamen Praxis und bietet robuste und zuverlässige Daten.
R26R-Confetti-Mäuse sind ein elegantes Werkzeug für die effiziente Verfolgung und das Studium der Natur und das Verhalten von Zellen in einem lebenden Organismus. Das System ist leicht festzustellen und erlaubt es nicht invasive Linienverfolgung einzelner Zellen während der Embryogenese, der Stammzellregeneration unter Homöostase oder unter anderen Umständen, wie beispielsweise Verletzungen, Entzündungen und Krebs. Die erzielbare Daten bietet eine robuste descriptIonen des Überlebens der angezielten Zellen, klonale Zellausdehnung und Zellmigration in einer quantifizierbaren Weise. Ein entscheidender Schritt wäre, um die entsprechende genetische Mausstamm, der zuverlässig erlauben können effiziente Gewebe spezifische Markierung an einer präzisen Entwicklungsstufe zu wählen. Eine Einschränkung bei diesem System ist, dass zur Überwachung eines lebenden Organismus, das Gewebe zugänglich und transparent sein. Ebenso Tracking ein dickes Gewebe in einem lebenden Tier nur durch Zwei-Photonen-oder Multi-Photonen-Mikroskopie ermöglicht werden. Jedoch Zellverfolgung möglich Obduktion Gewebeschnitten und vielleicht das intakte Gewebe untersucht, nachdem sie umgewandelt worden transparent durch die Klarheit Methode 32,33 zu werden werden. Eine weitere Einschränkung ist zu berücksichtigen, dass, obwohl benachbarten Zellen, die dieselbe Fluorophor Eil gehören wahrscheinlich zu demselben klonalen Linie, ist es auch möglich, dass sie von unabhängigen Zellen zurückzuführen, die zufällig dasselbe fluoreszierende Gen exprimiert ableiten. Diese Mögty wird sehr unwahrscheinlich, wenn mehrere Br Allele zu zahlreichen Farbkombinationen ermöglichen.
In der Zukunft, die Kombination der Confetti-System mit verfügbaren genetischen Werkzeugen (dh Knockout, Knockin und transgenen Mausmodellen) wird die Untersuchung von Genen und deren Mutationen in Gesundheit und Pathologie zu ermöglichen. Ebenso Lineage Tracing unter verschiedenen Netzrückwirkungen (dh Stammzellnische Zerstörung, Laser-vermittelte Zell-Ablation, medikamentöse Behandlung) wird neue Erkenntnisse auf die Beteiligung der Signalwege in Zellschicksal Entscheidungen zu bringen. Letztlich ist die kombinatorische Verwendung von fluoreszierenden und Biolumineszenz-Kennzeichnung, genetische Reporter von Signalwegen und Schneide-Mikroskopie werden die Forscher bieten ein robustes System zu lernen, wie einzelne Zellen auf ihre Umgebung in ihrer natürlichen Umgebung zu reagieren.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |