In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
भ्रूण विकास के दौरान, ऊतक और अंग morphogenesis सेल प्रसार, सेल प्रवास और वंश विनिर्देश 1-4 के संदर्भ में वर्णित किया जा सकता है कि एक सटीक कार्यक्रम के माध्यम से जगह ले लो। ये जैविक प्रक्रियाओं को भी सेल पुनर्जनन स्टेम की आवश्यकता है जो वयस्क ऊतक homeostasis, बनाए रखने में शामिल कर रहे हैं। वंश ट्रेसिंग, पहचान और सेल की आबादी का एक विशिष्ट प्रकार की संतान की ट्रैकिंग, भ्रूण का अध्ययन और सेल homeostasis स्टेम के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। दरअसल, यह तेजी से अनुसंधान के कई क्षेत्रों में उपयोग किया जा रहा है। विशेष रूप से, वंश ट्रेसिंग homeostasis और कैंसर के विकास में मूल और स्टेम सेल के भाग्य की पहचान करने में एक अनिवार्य उपकरण बन गया। यह सेल अलगाव के लिए और इन विट्रो संस्कृति या transplantati में इसके विपरीत में, कम से कम प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के साथ सेल बरकरार ऊतक या जीव के संदर्भ में कैसे बर्ताव के बारे में आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकता है, क्योंकि यह वह जगह हैउस पर अवांछित पूर्वाग्रह में हो सकता है।
परंपरागत रूप से, कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में शामिल है, जो इस तरह के लिपिड घुलनशील carbocyanine रूप रंग, वंश पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रयोगों के इन प्रकार के सफलतापूर्वक विकास जीव विज्ञान 5,6 में प्रमुख खोजों और आकार का मौलिक अवधारणाओं के लिए नेतृत्व किया है, वे लक्षित कोशिकाओं की विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए कठिनाई, सेल व्यवहार पर डाई के अवांछित प्रभाव और कमजोर पड़ने सहित कुछ सीमाएं हैं, समय के साथ लेबल के। न्यूक्लियोटाइड एनालॉग लेबलिंग दृष्टिकोण संभवतः स्टेम कोशिकाओं 7.8 मौन के अनुरूप है कि "लेबल को बनाए रखना कोशिकाओं" धीमी गति से साइकिल के अस्तित्व का दस्तावेजीकरण के लिए सक्षम है। इस तकनीक का एक सीमित समय अवधि में प्रसार कैनेटीक्स के आधार पर धीमी साइकिल चलाना कोशिकाओं की उपस्थिति का प्रदर्शन कर सकता है, जबकि हालांकि, यह स्टेम कोशिकाओं की कार्यक्षमता के बारे में पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं कर सके। एक इष्टतम वंश अनुरेखण मेथodology उल्लेखनीय सेल, अपनी संतान, या अपने पड़ोसियों के गुणों पर लेबलिंग के प्रभाव को कम करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यह एक मंच है और समय पर निर्भर तरीके के साथ-साथ एक एकल कोशिका (प्रतिरूप) ढंग से ब्याज की सेल की आबादी को टैग करने की क्षमता है, अर्थात्, लेबलिंग प्रेरण पर नियंत्रण करने के लिए फायदेमंद होगा। लेबल समय के साथ बनाए रखा, और पड़ोसी कोशिकाओं को हस्तांतरित नहीं किया जाएगा तो यह है कि संस्थापक सेल के सभी संतान को पारित कर दिया है कि एक स्थिर और अपरिवर्तनीय लेबलिंग विधि महत्वपूर्ण है।
हाल ही में, सेल लेबलिंग की आनुवंशिक दृष्टिकोण विकसित किए गए। इन प्रणालियों में, सेल विशिष्ट प्रमोटरों ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन या Β-galactosidase रिपोर्टर जीन 9-13 के रूप में रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति एक loxP-घिरे अंधी गली को दूर करने और अनुमति देने के लिए रचनात्मक Recombinase अभिव्यक्ति को गति प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण न केवल कोशिकाओं और उनके संतान की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है, लेकिन यह भी सेल है परमिटolation और आणविक लक्षण वर्णन। एकल कोशिका के स्तर पर सेल ट्रैकिंग एक एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति की प्रेरण से संभव हो गया। इस प्रणाली का एक महत्वपूर्ण सीमा कोशिकाओं की बहुत कम प्रतिशत अलग और व्यक्तिगत क्लोन का पता लगाने के लिए संभव है लेबल है कि केवल जब तथ्य है। बहुरंगा संवाददाताओं से इस्तेमाल किया जा सकता इस सीमा को पार करने के लिए। बहुरंगा लेबलिंग का उपयोग करते समय, एक ही जगह में पड़ोसी की कोशिकाओं के अंतर भाग्य की ट्रैकिंग कुशलता से 14-17 से हासिल किया जा सकता है। हाल ही में, Brainbow (बीआर) alleles की एक किस्म Cre / lox प्रणाली का उपयोग कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की एक स्टोकेस्टिक अभिव्यक्ति सक्षम करने, वंश अनुरेखण प्रयोगों के लिए विकसित किए गए। Cre / lox प्रणाली को पहचानता है और इस तरह के loxP साइटों के रूप में विशिष्ट डीएनए दृश्यों को बांधता है जो रचनात्मक Recombinase एंजाइम होते हैं। निम्नलिखित Cre Recombinase के बंधन, साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन होता है, loxP को हटाने की घिरे दृश्यों resultin का कारण बनता हैविभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के यादृच्छिक अभिव्यक्ति में जी (तंत्र नीचे वर्णित है)। बीआर लाइनों की एक किस्म (समीक्षा 16,18,19 देखें) उपयोग के लिए उपलब्ध हैं। बीआर प्रकारों के बीच बड़े मतभेद 2 (बीआर 2.0), 3 (Br1.0) से 4 (Br1.1, Br2.1) फ्लोरोसेंट जीन को लेकर कैसेट में शामिल फ्लोरोसेंट जीनों की संख्या में (मैं) मतभेद शामिल (ii) आपस में केंद्रित Lox साइटों की उपस्थिति का इस्तेमाल किया Lox साइटों (iii) के प्रकार, और (iv) अभिव्यक्ति या फ्लोरोसेंट जीन अभिव्यक्ति की चुप्पी से पहले Cre सक्रियण के लिए, जीन उलटा (Br2.0-2.1) की अनुमति है। हाल ही में स्थापित Br3 न्यूरॉन्स की बहुरंगा इमेजिंग के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान करता है। इस प्रतिलेख की मुख्य विशेषताओं में से एक यह बेहतरीन न्यूरोनल का एक भी धुंधला 20 प्रक्रियाओं जो सक्षम photostable farnesylated फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक नया सेट होता है।
महत्वपूर्ण बात है, बीआर कैसेट के विभिन्न संस्करणों Thy1 जनसंपर्क न्यूरोनल विशिष्ट हो सकती हैomoter या सर्वत्र सीएजी (सीएमवी) प्रमोटर व्यक्त किया। बीआर ट्रांसजेनिक चूहों में से कुछ एक एकल बीआर ट्रांस्जीन हो सकती है, जबकि अंत में, दूसरों जिससे प्रत्येक कोशिका में व्यक्त किया जा करने के लिए रंग संयोजन के लिए संभावनाओं की एक विशाल संख्या के उत्पादन की अनुमति, कई ट्रांस्जीन प्रतियां शामिल हो सकते हैं (उदाहरण के लिए 16 देखें)।
हमारे अध्ययन में, हम बीआर 2.1 कैसेट 21 में शामिल है जो R26R-कंफ़ेद्दी माउस का प्रयोग किया। Br2.1 विशिष्ट रचनात्मक मध्यस्थता डीएनए व्युत्क्रमों और क्योंकि loxP साइटों (चित्रा 1) के पारस्परिक उन्मुखीकरण का न केवल excisions अनुमति देने के लिए बनाया गया है। इस प्रकार, रंग बदलने के लिए नेतृत्व जो इन उलटा / छांटना घटनाओं के रूप में लंबे समय रचनात्मक 16 मौजूद है के रूप में जारी रख सकते हैं। कारण है कि, एक inducible अस्थायी रचनात्मक अभिव्यक्ति प्रणाली विश्वसनीय सेल ट्रैकिंग Br2.1 उपयोग करने के लिए आवश्यक है। चित्र में दिखाया गया है। 1, Br2.1 loxP-घिरे नव आर -casse के बाद एक सर्वव्यापी सीएजी प्रमोटर शामिलएक ट्रांसक्रिप्शनल अंधी गली के रूप में कार्य करता है जो टीटीई, कि दो tandems में तैनात पीले हरे रंग के लिए 4 फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन, एन्कोडिंग (GFP), (YFP), लाल (आरएफपी) और सियान (सीएफपी) फ्लोरोसेंट प्रोटीन, द्वारा पीछा किया जाता है। कोई प्रतिदीप्ति Cre सक्रियण करने से पहले व्यक्त की है। Cre Recombinase की प्रेरण एक दिया सेल में 4 फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक यादृच्छिक अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के नव-आर कैसेट के हटाने का कारण बनता है। दूसरे खंड loxP-घिरे आरएफपी और एक उलट सीएफपी होता है, जबकि पहले खंड, loxP-घिरे GFP और एक उलट YFP शामिल हैं। ये डीएनए खंडों लगातार रूप में लंबे समय रचनात्मक Recombinase मौजूद है, (उलट अभिविन्यास में है कि loxP का उपयोग) उल्टे, या excised जा सकता है। इसलिए, एक क्षणिक और नियंत्रित Cre ट्रांस्जीन इस्तेमाल किया जाना चाहिए। YFP की अभिव्यक्ति और आरएफपी साइटोप्लास्मिक है, GFP के परमाणु और सीएफपी कोशिका झिल्ली के लिए बाध्य है: Br2.1 कैसेट संकेत स्थान पर ओवरलैपिंग उत्सर्जन के बीच भेद के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है। GFPऔर आरएफपी उत्सर्जन आसानी से पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से अलग होती है। YFP / GFP / सीएफपी उत्सर्जन को अलग करने के लिए, एक वर्णक्रमीय confocal इमेजिंग प्रणाली की जरूरत है। कुल मिलाकर, Br2.1 कैसेट प्रत्येक लक्षित सेल में एक चार के बाहर अलग फ्लोरोसेंट जीन की, यादृच्छिक inducible, और ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। रंग संयोजन की एक बड़ी संख्या की जरूरत है जब वास्तव में, एक इस प्रकार प्रत्येक कक्ष के लिए 2 रंग टैग की अभिव्यक्ति में और 10 को संभव रंग संयोजन की संख्या में बढ़ोतरी के लिए, जिसके परिणामस्वरूप Br2.1 के 2 एलिलों होते हैं कि समयुग्मक चूहों उत्पन्न कर सकते हैं कैसेट की कई प्रतियां उनके जीनोम 16 में एकीकृत किया गया के बाद से 22। बीआर माउस उपभेदों के कुछ संभव रंग संयोजन की एक बहुत बड़ी संख्या की अभिव्यक्ति के लिए सक्षम करें। फिर भी, ज्यादातर मामलों में, एक भी Br2.1 एलील द्वारा प्रदान की चार रंग संयोजन के लिए पर्याप्त हैं। यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल के बाद, एक Spectr की एक अपेक्षाकृत सरल सेटअप का उपयोग इस पद्धति स्थापित कर सकते हैंजांच के लिए छोटे से अगर किसी की जरूरत के साथ अल माइक्रोस्कोपी।
यहाँ हम कार्निया उपकला के वंश अनुरेखण प्रयोगों के लिए, एक भी Br2.1 एलील होते हैं कि R26R-कंफ़ेद्दी चूहों के उपयोग के लिए एक अनुकूलनीय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस ट्रांसजेनिक माउस तनाव पेट के 21,23 और कार्निया उपकला स्टेम कोशिकाओं 22,24 का मूल है और भाग्य के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, और फोकल कमानी ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस में गुर्दे podocyte निस्र्पक के लिए आंत्र कैंसर 25 में स्टेम सेल गतिविधि की उपस्थिति (FSGS) 17।
वंश अनुरेखण प्रयोगों कई वर्षों के लिए आयोजित किया गया है। हाल ही में तकनीकी सुधार और कंफ़ेद्दी माउस उपभेदों के उद्भव के अनुसंधान के लिए नए रास्ते खोल दिया। आज, शोधकर्ताओं ने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक विशेष रचनात्मक लाइनों, पीटा चूहों और ट्रांसजेनिक चूहों की एक बड़ी संख्या से फायदा हो सकता है। यह मजबूत और विश्वसनीय डेटा प्रदान करते हुए, श्रमसाध्य अभ्यास से परहेज, बुनियादी विशेषज्ञता के साथ वैज्ञानिक सवालों के समाधान के लिए बहुमुखी प्रायोगिक प्रणाली डिजाइन करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है।
R26R-कंफ़ेद्दी चूहों कुशल ट्रैकिंग और एक जीवित जीव में कोशिकाओं की प्रकृति और व्यवहार के अध्ययन के लिए एक सुंदर उपकरण हैं। प्रणाली स्थापित करने के लिए आसान है और यह, embryogenesis दौरान एकल कक्षों के गैर इनवेसिव वंश ट्रेसिंग की अनुमति देता है स्टेम सेल पुनर्जनन समस्थिति के तहत, या इस तरह के चोट, सूजन और कैंसर के रूप में विभिन्न परिस्थितियों में। प्राप्य डेटा एक मजबूत descript प्रदान करता हैएक quantifiable तरीके से लक्षित कोशिकाओं, प्रतिरूप सेल विस्तार और सेल प्रवास के अस्तित्व के आयन। एक महत्वपूर्ण कदम मज़बूती से एक सटीक विकास के चरण में कुशल ऊतक विशिष्ट लेबलिंग अनुमति कर सकते हैं कि उचित आनुवंशिक माउस तनाव का चयन करने के लिए किया जाएगा। इस प्रणाली की एक सीमा एक जीवित जीव की निगरानी के लिए, ऊतक सुलभ और पारदर्शी होना चाहिए। इसी तरह, एक जीवित जानवरों के भीतर एक मोटी ऊतक पर नज़र रखने के लिए केवल दो photon या बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मदद की जा सकती है। हालांकि, सेल ट्रैकिंग पोस्टमार्टम ऊतक वर्गों पर संभव है और यह स्पष्टता विधि 32,33 से पारदर्शी बनने के लिए बदल दिया गया है के बाद शायद बरकरार ऊतक का अध्ययन किया जा सकता है। माना जा करने के एक और सीमा एक ही fluorophore कि एक्सप्रेस सन्निकट कक्षों की संभावना एक ही प्रतिरूप वंश के हैं, हालांकि, यह है कि वे बेतरतीब ढंग से एक ही फ्लोरोसेंट जीन व्यक्त की है कि स्वतंत्र सेल मूल से प्राप्त किया जा सकता है कि यह भी संभव है कि है। इस possibiliकई रंग संयोजन की अनुमति देने के लिए कई बीआर एलिलों का उपयोग करते समय Ty बहुत संभावना नहीं बन जाता है।
भविष्य में, जीन और स्वास्थ्य और विकृति में उनकी म्यूटेशन के अध्ययन की अनुमति होगी उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों (यानी, पीटा, Knockin और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल) के साथ कंफ़ेद्दी प्रणाली के संयोजन। इसी तरह, वंश सेल भाग्य का निर्णय में संकेत दे रास्ते की भागीदारी पर नए अंतर्दृष्टि लाएगा अलग प्रणाली अव्यवस्थाएं (यानी, सेल आला विनाश, लेजर मध्यस्थता सेल पृथक, दवा इलाज स्टेम) के तहत ट्रेसिंग। अंत में, फ्लोरोसेंट और bioluminescence लेबलिंग का मिश्रित उपयोग, धार माइक्रोस्कोपी रास्ते संकेतन और काटने की आनुवंशिक संवाददाताओं से शोधकर्ताओं ने अपने अपने देशी वातावरण में आसपास का जवाब कैसे एकल कक्षों जानने के लिए एक मजबूत प्रणाली प्रदान करेगा।
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |