In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Under embryonal utvikling, vev og organ morphogenesis skje gjennom et presist program som kan beskrives i form av celleproliferasjon, cellemigrasjon og avstamning spesifikasjon 1-4. Disse biologiske prosesser er også involvert i å opprettholde homeostase voksent vev, noe som krever stamcelle regenerering. Lineage tracing, identifisering og sporing av avkommet av en bestemt type cellepopulasjon, gir et viktig verktøy for å studere embryogenese og stamcelle homeostase. Faktisk er det i økende grad blir brukt i mange forskningsfelt. Spesielt ble avstamning tracing et viktig verktøy i å identifisere opprinnelsen og skjebnen til stamceller i homeostase og kreftutvikling. Dette er fordi det kan tilveiebringe viktig informasjon om hvordan cellen oppfører seg i sammenheng med intakt vev eller organisme, med minimal eksperimentell inngrep, i motsetning til celle isolering og in vitro-kultur eller transplantatipå som kan føre til uønsket skjevhet.
Tradisjonelt, fargestoffer som for eksempel lipid-oppløselige carbocyanine, som innlemme inn i plasmamembranen til celler, ble anvendt for avstamning tracing. Selv om slike forsøk har med hell ført til store oppdagelser og formede seminale begreper i utviklingsbiologi 5,6, har de noen begrensninger, blant annet vanskeligheter med å kontrollere spesifisiteten av målceller, den uønskede virkningen av fargestoffet på celle atferd og fortynningen av markøren over tid. Nukleotidanalog merking tilnærminger har aktivert dokumentere eksistensen av slow-sykling "label beholde celler" som antakelig tilsvarer stille stamceller 7,8. Men mens denne teknikken kan påvise langsomme sykkel celler basert på spredningskinetikk over en begrenset tidsperiode det ikke kunne gi betydelige innsikt om funksjonaliteten til stamceller. En optimal avstamning tracing methodology skal minimere effekten av merkingen på egenskapene til den markerte cellen, dets avkom, eller dens naboer. I tillegg vil det være fordelaktig å ha kontroll på merkingen induksjon, nemlig å ha mulighet for å merke cellepopulasjonen av interesse ved et trinn og tidsavhengig måte, så vel som i en enkelt celle (klonale) måte. En stabil og irreversibel merking metode som er sendt videre til alle avkom av grunnleggeren cellen er viktig slik at etiketten ville bli beholdt over tid, og ikke overføres til nabocellene.
Flere nylig, ble genetiske metoder for celle merking utviklet. I disse systemene kan cellespesifikke promotere brukes til å utløse Cre rekombinase uttrykk for å fjerne et loxP-flankert hindring og tillate ekspresjon av rapportørgener slik som grønt fluorescerende protein eller Β-galaktosidase-reportergener 9-13. Denne tilnærmingen muliggjør ikke bare sporing av celler og deres avkom, men tillater også celle erolation og molekylær karakterisering. Celle sporing på celle-nivået ble mulig ved induksjon av ekspresjonen av en enkelt fluorescerende reportergen. En viktig begrensning ved dette system er det faktum at bare når meget lav prosentandel av celler som er merket det er mulig å separere og spore individuelle kloner. For å overvinne denne begrensningen flerfarget journalister kan brukes. Når du bruker flerfarget merking, kan sporing av differensial skjebnen til nabocellene i samme nisje oppnås effektivt 14-17. Nylig ble en rekke Brainbow (BR) alleler utviklet for avstamning tracing eksperimenter, slik at en stokastisk uttrykk for flere fluorescerende reporter gener utnytte Cre / lox system. Den Cre / lox Systemet består av en Cre rekombinase enzym, som gjenkjenner og binder til spesifikke DNA-sekvenser som loxP-seter. Etter binding av Cre rekombinase, stedsspesifikke rekombinasjon skjer, noe som fører til fjerning av loxP flankert sekvenser resulting i tilfeldig ekspresjon av forskjellige fluorescerende proteiner (mekanismen er beskrevet nedenfor). En rekke Br linjene er tilgjengelig for bruk (se vurderinger 16,18,19). De store forskjellene mellom Br stammer inkluderer (i) forskjeller i antall fluorescerende gener som inngår i kassetten, alt fra 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) til 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescerende gener , (ii) nærværet av gjensidig orientert lox sider for å tillate gen inversjon (Br2.0-2.1), (iii) den type lox områder som benyttes, og (iv) ekspresjon eller stillheten av fluorescerende genekspresjon før Cre aktivering. Det nylig etablerte BR3 tilbyr en forbedret metode for flerfarget avbildning av nerveceller. En av de viktigste funksjonene i denne transkripsjon er at den inneholder et nytt sett med fotostabile farnesylated fluorescerende proteiner, som gjør en enda farging av de fineste nevronale behandler 20.
Viktigere, kan forskjellige versjoner av Br kassetter inneholde nevronale bestemt Thy1 promoter eller overalt uttrykt CAG (CMV) promoter. Til slutt, mens noen av de Br transgene mus kan inneholde en enkelt Br transgen, mens andre kan bestå av flere transgene eksemplarer, for derved å tillate fremstilling av et enormt antall muligheter for fargekombinasjoner skal uttrykkes i hver celle (se for eksempel 16).
I vår studie har vi brukt R26R-Confetti mus som inneholder Br 2,1 kassett 21. Br2.1 er unikt designet for å tillate Cre-mediert DNA inversjoner og ikke bare excisions grunn av gjensidig orientering av loxP områder (figur 1). Således kan disse inversjon / eksisjons- hendelser som fører til fargeendring fortsette så lenge Cre er til stede 16. Av den grunn er en induserbar temp Cre uttrykk system viktig for pålitelig celle sporing ved hjelp Br2.1. Som vist i fig. 1, inneholder Br2.1 en allestedsnærværende CAG promoter fulgt av loxP-flankert Neo R -cassette, som fungerer som en transkripsjons veisperring, som er etterfulgt av 4 fluorescerende reporter gener, koding for grønn (GFP), gul (YFP), rød (RFP) og cyan (CFP) fluorescerende proteiner, plassert i to tandemsykler. Ingen fluorescens er uttrykt før Cre aktivering. Induksjon av Cre rekombinase bevirker fjerning av Neo-R-kassetten slik at den tilfeldige ekspresjon av en av de 4 fluorescerende proteiner i en gitt celle. Det første segmentet inneholder loxP-flankert GFP og en reversert YFP, mens det andre segment inneholder loxP-flankert RFP og en reversert CFP. Disse DNA-segmenter fortløpende kan byttes om (ved hjelp av loxP det vil si i motsatt retning) eller utskåret, så lenge Cre rekombinase er til stede. Derfor bør en forbigående og kontrollert Cre transgenet benyttes. Den Br2.1 kassetten gir et godt system for å skjelne mellom overlappende utslipp ved signal sted: ekspresjon av YFP og RFP er cytoplasmisk, GFP er atom og CFP er bundet til cellemembranen. GFPog RFP utslipp lett separeres ved hjelp av konvensjonell fluorescerende mikroskopi. For å skille YFP / GFP / CFP-utslipp, er en spektral confocal imaging system nødvendig. Alt i alt tillater Br2.1 kassetten tilfeldig, induserbare og vevsspesifikke ekspresjon av en av fire forskjellige fluorescerende gener i hvert målrettet celle. Faktisk, når et større antall fargekombinasjoner er nødvendig, kan man generere homozygote mus som inneholder 2 alleler av Br2.1, noe som resulterer i ekspresjonen av 2 fargekoder for hver celle, og i å øke antall mulige fargekombinasjoner til 10 22. Noen av de Br musestammer muliggjøre ekspresjon av et mye større antall mulige fargekombinasjoner ettersom flere kopier av kassetten ble integrert inn i deres genom 16. Men i de fleste tilfeller de fire fargekombinasjoner som leveres av en enkelt Br2.1 allel er tilstrekkelig. Etter protokollen gitt her, kan man etablere denne metoden bruker en relativt enkel oppsett av spectral mikroskopi med lite, om noe behov for kalibrering.
Her gir vi en tilpasningsdyktig protokoll for anvendelse av R26R-Confetti mus som inneholder en enkelt Br2.1 allel, for sporing avstamning eksperimenter cornealepitelets. Dette transgen musestamme er blitt benyttet for å studere sted skjebnen til tykktarm 21,23 og corneale epitele stamceller 22,24, tilstedeværelse av stamcelle-aktivitet i intestinal cancer 25, og for å karakterisere nyre podocyte i fokal segmentell glomerulosklerose (FSGS) 17.
Lineage tracing eksperimenter har blitt utført i mange år. De siste teknologiske forbedringer og fremveksten av Confetti musestammer åpnet nye veier for forskning. Dag, kan forskere ha nytte av et stort antall kommersielt tilgjengelige vevsspesifikke Cre linjer, knockout-mus og transgene mus. Dette gir en mulighet for å designe allsidig eksperimentelle systemer for adressering vitenskapelige spørsmål med grunnleggende kompetanse, unngå arbeidskrevende praksis, samtidig som det gir robuste og pålitelige data.
R26R-Confetti mus er et elegant verktøy for effektiv sporing og studere naturen og oppførselen til cellene i en levende organisme. Systemet er enkelt å etablere og det tillater ikke-invasiv avstamning sporing av enkeltceller under embryogenese, stamcelle regenerering etter homeostase, eller under andre omstendigheter som skade, betennelse og kreft. Oppnåelig data gir et robust beskrivendeion av overlevelse av målrettede celler, celle klonal ekspansjon og cellemigrasjon, på en kvantifiserbar måte. Et kritisk skritt vil være å velge riktig genetisk musestamme som kan sikkert tillate effektiv vevsspesifikk merking på en presis utviklingsstadiet. En begrensning ved dette system er at for å overvåke en levende organisme, må vevet være tilgjengelig og gjennomsiktig. Tilsvarende sporing av et tykt vev i et levende dyr, kan bare lettes ved to-foton eller multi-foton mikroskopi. Imidlertid er celle sporing mulig på postmortem vevssnitt og kanskje intakt vev kan bli studert etter at den har blitt transformert til å bli gjennomsiktig ved KLARHET metode 32,33. En annen begrensning tas i betraktning, er at selv om tilstøtende celler som uttrykker det samme fluoroforen sannsynligvis tilhører samme klonale avstamning, er det også mulig at de kan være avledet fra uavhengige celleopprinnelse som tilfeldig uttrykk for det samme fluorescerende genet. Dette possibility blir svært usannsynlig når du bruker flere Br alleler å tillate en rekke fargekombinasjoner.
I fremtiden kombinere Confetti system med tilgjengelige genetiske verktøy (dvs. knockout, Knockin og transgene musemodeller) vil tillate studiet av gener og deres mutasjoner i helse og patologi. Likeledes, avstamning sporing under forskjellige system forstyrrelser (dvs. stamcelle nisje ødeleggelse, laser mediert celle ablasjon, medikamentell behandling) vil bringe ny innsikt på involvering av signalveier i cellen skjebne beslutninger. Til syvende og sist den kombinatoriske bruk av fluoriserende og bioluminescens merking, vil genetiske journalister av signalveier og cutting edge mikros gi forskerne et robust system for å lære hvordan enkeltceller svare på deres rundt i sitt opprinnelige miljø.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |