In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Under fosterutvecklingen, vävnader och organ morfogenes ske genom ett detaljerat program som kan beskrivas i termer av celltillväxt, cellmigration och härstamning specifikation 1-4. Dessa biologiska processer är också involverade i att upprätthålla vuxna vävnadshomeostas, vilket kräver stamcells förnyelse. Härstamning spårning, identifiering och spårning av avkomman av en viss typ av cellpopulationen, utgör ett viktigt verktyg för att studera embryogenes och stamcells homeostas. I själva verket är det allt används i många forskningsområden. Särskilt blev härstamning spårning ett viktigt verktyg för att identifiera ursprung och öde stamceller i homeostas och cancerutveckling. Detta beror på att det kan ge viktig information om hur cellen fungerar inom ramen för den intakta vävnad eller organism, med minimal experimentella ingripande, i motsats till cellisolering och odling in vitro eller transplantatipå som kan resultera i oönskad förspänning.
Traditionellt färgämnen såsom lipidlösliga karbocyanin, som inkorporerar in i plasmamembranet hos celler, användes för härstamning spårning. Även om dessa typer av experiment har framgångsrikt lett till stora upptäckter och formade nyskapande begrepp inom utvecklingsbiologi 5,6, de har vissa begränsningar, bland annat svårigheten att kontrollera specificiteten hos målceller, den oönskade effekten av färgämnet på cellens beteende och utspädning av etiketten över tiden. Nukleotidanalog märkning metoder har gjort det möjligt att dokumentera förekomsten av slow-cykling "etikettkvarhållande celler" som förmodligen motsvarar vilande stamceller 7,8. Även denna teknik kan visa närvaron av långsamma cykel celler baserat på spridnings kinetik under en begränsad period inte kunde ge betydande insikter om funktionaliteten hos stamceller. En optimal härstamning spåra methodology bör minimera effekten av märkningen på egenskaperna hos den markerade cellen, dess avkomma eller dess grannar. Dessutom skulle det vara fördelaktigt att ha kontroll på märkningen induktion, nämligen att ha förmågan att märka cellpopulationen av intresse på en scen och tidsberoende sätt samt i en enda cell (klonal) sätt. En stabil och irreversibel metod märkning som förs vidare till all avkomma av grundaren cellen är viktigt så att etiketten skulle behållas över tiden, och inte överföras till angränsande celler.
På senare tid har genetiska metoder för cell märkning framtagen. I dessa system kan cellspecifika promotorer användas för att utlösa Cre-rekombinas uttryck i syfte att avlägsna en loxP-flankerad vägspärr och tillåta uttrycket av reportergener, såsom grönt fluorescerande protein eller Β-galaktosidas reportergenerna 9-13. Detta tillvägagångssätt möjliggör inte bara spårning av celler och deras avkomma utan tillåter även cell ärolation och molekylär karakterisering. Cell spårning vid enkelcellnivån blev möjligt genom induktion av expression av en enda fluorescerande reportergenen. En viktig begränsning av detta system är det faktum att endast när mycket låg procentandel av celler är märkt är det möjligt att separera och spåra individuella kloner. För att övervinna denna begränsning multicolor reportrar kan användas. När du använder flerfärgad märkning, kan uppnås spårning av differential öde angränsande celler i samma nisch effektivt 14-17. Nyligen genomfördes en rad olika Brainbow (Br) alleler utvecklad för härstamning spåra experiment, vilket möjliggör en stokastisk uttryck av flera fluorescerande reportergener utnyttjar Cre / lox-systemet. Cre / lox-systemet består av Cre-rekombinas enzym, som känner igen och binder till specifika DNA-sekvenser såsom loxP-ställen. Efter bindningen av Cre-rekombinas, platsspecifik rekombination sker, vilket orsakar borttagning av loxP flankerad sekvenser resulting i slumpmässig expression av olika fluorescerande proteiner (mekanismen beskrivs nedan). En mängd olika Br linjer är tillgängliga för användning (se omdömen 16,18,19). De stora skillnaderna mellan Br stammar innefattar (i) skillnader i antalet fluorescerande gener som ingår i kassetten, från 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) till 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescerande gener (ii) förekomsten av ömsesidigt orienterade lox-ställen för att möjliggöra gen inversion (Br2.0-2.1), (iii) vilken typ av lox-ställen som används, och (iv) uttryck eller tystnad fluorescerande genuttryck före Cre aktivering. Den nyligen etablerade Br3 erbjuder en förbättrad metod för flerfärgsbildalstring av nervceller. Ett av de viktigaste inslagen i detta transkript är att det innehåller en ny uppsättning av fotostabil farnesylated fluorescerande proteiner, som gör det möjligt en jämn färgning av de finaste neuronala processer 20.
Viktigt, kan olika versioner av Br kassetter innehåller den neuronala specifika Thy1 promoter eller ubiquitously uttryckt CAG (CMV) promotor. Slutligen, medan några av de Br transgena möss kan innehålla en enda Br transgen kan andra består av flera transgena kopior, varigenom produktionen av ett enormt antal möjligheter för färgkombinationer skall uttryckas i varje cell (se till exempel 16).
I vår studie har vi använt R26R-konfetti mus som innehåller Br 2.1 kassetten 21. Br2.1 är unikt utformad så att Cre-förmedlad DNA-inversioner och inte bara excisioner grund för ömsesidigt orienteringen av loxP-ställen (Figur 1). Sålunda kan dessa inversion / excision händelser som leder till färgförändring fortsätta så länge som Cre är närvarande 16. Av den anledningen är en inducerbar temporal Cre-expressionssystem väsentliga för pålitlig cellspårning med användning Br2.1. Såsom visas i fig. 1, den Br2.1 innehåller en allestädes närvarande CAG promotor följt av loxP-flankerad Neo R -cassette, som fungerar som en transkriptions vägspärr, är den som följt av 4 fluorescerande reportergener, som kodar för grönt (GFP), gul (YFP), röd (RFP) och cyan (GFP) fluorescerande proteiner, placerade i två tandem. Ingen fluorescens uttrycks före Cre aktivering. Induktion av Cre-rekombinas förorsakar avlägsnandet av Neo-R-kassetten möjliggör slumpmässig expression av en av de 4 fluorescerande proteinerna i en given cell. Det första segmentet innehåller loxP-flankerad GFP och en omvänd YFP, medan det andra segmentet innehåller loxP-flankerad RFP och en omvänd GFP. Dessa DNA-segment kan kontinuerligt inverteras (med användning av loxP som är i omvänd orientering) eller exciderad, så länge som Cre-rekombinas är närvarande. Därför bör en övergående och kontrollerad Cre transgen användas. Den Br2.1 kassetten ger ett utmärkt system för att skilja mellan överlappande utsläpp vid signal plats: ett uttryck för YFP och RFP är cytoplasma, GFP är kärnkraft och den gemensamma fiskeripolitiken är bunden till cellmembranet. GFPoch RFP utsläpp separeras lätt genom konventionell fluorescensmikroskopi. För att separera YFP / GFP / GFP utsläpp, behövs en spektral konfokalt avbildningssystem. Sammantaget tillåter Br2.1 kassetten slump, inducerbar och vävnadsspecifikt uttryck av en av fyra distinkta fluorescerande gener i varje riktad cell. Faktum är att när ett större antal färgkombinationer som behövs, kan en generera homozygot möss som innehåller 2 alleler av Br2.1, vilket sålunda resulterar i uttrycket av 2 färg taggar för varje cell och för att höja antalet möjliga färgkombinationer till 10 22. Några av de musstammar Br möjliggöra expressionen av ett mycket större antal möjliga färgkombinationer, eftersom flera kopior av kassetten integrerades i deras genom 16. Men i de flesta fall, de fyra färgkombinationer som tillhandahålls av en enda Br2.1 allel är tillräckliga. Efter det protokoll som avses här, kan man konstatera denna metod med hjälp av en relativt enkel installation av Spectral mikroskopi med lite om något behov av kalibrering.
Här ger vi ett anpassningsbart protokoll för användning av R26R-Konfettiar möss som innehåller en enda Br2.1 allel, för härstamning spårning experiment hornhinneepitelet. Denna transgen musstam har använts för att studera ursprung och öde kolon 21,23 och korneala epitelstamceller 22,24, närvaron av stamcellaktivitet i tarmcancer 25, och för att karakterisera njure podocyte i fokal segmental glomeruloskleros (FSGS) 17.
Lineage spårande experiment har utförts i många år. Den senaste tidens tekniska förbättringar och framväxten av musstammar konfetti öppnat nya vägar för forskning. Idag kan forskare dra nytta av ett stort antal kommersiellt tillgängliga vävnadsspecifika Cre linjer, knockoutmöss och transgena möss. Detta ger en möjlighet för att utforma mångsidiga experimentella system för att hantera vetenskapliga frågor med grundläggande kompetens, undvika mödosam praxis, samtidigt som den ger robusta och tillförlitliga uppgifter.
R26R-Konfettiar möss är en elegant redskap för effektiv spårning och studera arten och beteendet hos celler i en levande organism. Systemet är lätt att etablera och det gör icke-invasiv härstamning spårning av enskilda celler under embryogenes, stamcells förnyelse enligt homeostas, eller under olika omständigheter såsom skada, inflammation och cancer. Den kan erhållas data ger en robust Uppgjon av överlevnaden av målceller, klonal expansion cell och cellmigration i ett kvantifierbart sätt. Ett kritiskt steg skulle vara att välja en lämplig genetisk musstam som tillförlitligt kan tillåta effektiv vävnadsspecifik märkning på en exakt utvecklingsstadium. En begränsning hos detta system är att för övervakning av en levande organism, måste vävnaden vara tillgängligt och öppet. På liknande sätt kan spåra en tjock vävnad i ett levande djur endast underlättas av två-foton eller multifoton mikroskopi. Men är det möjligt spårning cell på postmortem vävnadssnitt och kanske intakt vävnad kan studeras efter att den har transformerats för att bli tydligare genom CLARITY metoden 32,33. En annan begränsning som skall beaktas är att även om angränsande celler som uttrycker samma fluorofor hör sannolikt till samma klonala härstamning, är det även möjligt att de kan härledas från oberoende cellursprung som slumpmässigt uttryckte samma fluorescerande genen. Denna possibility blir mycket osannolikt när man använder flera Br alleler för att möjliggöra ett flertal färgkombinationer.
I framtiden kombinera Confetti systemet med tillgängliga genetiska verktyg (dvs. knockout, Knockin och transgena musmodeller) kommer att möjliggöra studier av gener och deras mutationer i hälsa och patologi. På samma sätt, härstamning spårning med olika systemstörningar (dvs stamceller nisch förstörelse, laser-medierad cell ablation, läkemedelsbehandling) kommer att ge nya insikter på medverkan av signalvägar i cellen öde beslut. I slutändan, den kombinatoriska användning av fluorescerande och mareld märkning, kommer genetiska reportrar signalvägar och banbrytande mikroskopi ge forskare ett robust system för att lära sig hur enstaka celler reagerar på sin omgivning i sin ursprungliga miljö.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |