Een veelzijdige muizenmodel van Subcortical White Matter Stroke voor de Studie van axonale degeneratie en White Matter Neurobiologie

Summary

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Abstract

Stroke invloed witte stof kan oplopen tot 25% van de klinische beroerte presentaties, gebeurt in stilte tegen tarieven die 5-10 keer groter kunnen zijn, en draagt ​​aanzienlijk bij aan de ontwikkeling van vasculaire dementie. Er zijn maar weinig modellen van focale witte stof beroerte bestaan ​​en dit gebrek aan geschikte modellen heeft inzicht in de neurobiologische mechanismen die betrokken zijn in blessuretijd respons en herstel na dit type van een beroerte belemmerd. De belangrijkste beperking van andere subcorticale beroerte modellen is dat ze het infarct tot de witte stof niet focaal beperken of zijn in de eerste plaats zijn gevalideerd in niet-muizen soorten. Dit beperkt de mogelijkheid om de grote verscheidenheid van murine onderzoeksinstrumenten toepassing op neurobiologie witte massa beroerte bestuderen. Hier presenteren we een methode voor de betrouwbare productie van een focale beroerte bij muizen witte stof met een lokale injectie van een irreversibele inhibitor eNOS. We hebben ook verschillende varianten te presenteren over de algemene protocol waaronder twee unieke stereotactischevariaties retrograde neuronale tracing, alsmede labeling vers weefsel dissectie en de mogelijke toepassingen van deze techniek uit te breiden. Deze variaties mogelijk voor meerdere benaderingen voor de neurobiologische effecten van deze gemeenschappelijke en onderbestudeert vorm van een beroerte te analyseren.

Introduction

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

Protocol

Het gebruik van dieren in dit protocol is uitgevoerd in overeenstemming met de procedures die door de University of California Los Angeles Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. Let op: Begin met het identificeren van de doelgroep muizen bevolking. In eerdere studies hebben alleen mannelijke wildtype C57 / Bl6 muizen gebruikt echter verschillende transgene of knockout muizen kunnen ook worden gebruikt. Merk op dat stereotactische coördinaten op basis van C57 / Bl6 anatomie. Aanbevolen w…

Representative Results

Met behulp van het model gepresenteerd, kan de witte stof onderliggende voorpoot sensomotorische cortex betrouwbaar kan worden gericht. Dit chemisch geïnduceerde focale beroertemodel produceert axonale en myeline verlies astrocytose en microgliose (figuur 1), zoals typisch waargenomen in menselijke lacunaire infarcten. Via drie injecties, wordt een klinisch bruikbaar model vastgesteld met vroege stoornissen op motorische taken voorpoot 7 en een kleine maar si…

Discussion

Een aantal eerdere modellen van subcorticale beroerte zijn beschreven, waaronder focale injecties van endotheline-1 in de interne capsule, subcorticale witte stof en striatum bij de rat en de muis ^{12-14 6,15.} Recentere modellen van kleine focale beroerte hebben gebruikt cholesterol microembolieën injectie in de halsslagader ¹⁶ en fototrombotisch occlusie van een enkele doordringende arteriole ^17. Elk van deze modellen heeft zowel voor- als nadelen ^5. De hier beschr…

Materials

L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810