축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크
Summary
Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.
Abstract
뇌졸중 임상 스트로크 프리젠 테이션의 최대 25 %를 백질 계정에 영향을주지는 5 ~ 10 배 더 클 수있다 속도에서 자동으로 발생하고 혈관성 치매의 발전에 크게 기여하고있다. 초점 백질 행정의 몇 가지 모델이 존재하고 적절한 모델이 부족 뇌졸중 이러한 유형의 후 부상 응답 및 수리에 관련된 neurobiologic 메커니즘의 이해를 방해하고있다. 다른 피질 뇌졸중 모델의 주요 제한은 국소 적 백질에 경색을 제한하지 않거나 주로 비 뮤린 종 검증되었다는 것이다. 이것은 백질 행정 신경 생물학을 연구 쥐 연구 도구의 다양한 적용 할 수있는 능력을 제한한다. 여기에서 우리는 돌이킬 수없는 eNOS의 억제제의 지방 주입을 사용하여 쥐의 흰색 문제에 초점 뇌졸중의 안정적인 생산을위한 방법론을 제시한다. 우리는 또한이 독특한 정위를 포함하는 일반적인 프로토콜에 몇 가지 변화를 제시변화, 크게이 기술의 응용 가능성을 확장 역행의 연결을 추적뿐만 아니라 신선한 조직 라벨 및 해부. 여러 방법이 뇌졸중이 일반적이고 파악 하였다 형태의 neurobiologic 효과를 분석하는 이러한 변화 할 수 있습니다.
Introduction
Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US 1. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia 2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist 4,5.
The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.
Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) 6 that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded 7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.
The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) 9 with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 10. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.
Protocol
Representative Results
Discussion
피질 행정 이전 모델 번호 12-14 래트 및 마우스에서 내부 -6,15- 캡슐에 엔도 텔린 -1의 국소 주입, 피질 및 선조체 백질 포함 설명되었다. 작은 초점 스트로크의 최근 모델은 콜레스테롤 microemboli의 경동맥 (16)에 주입 한 번의 침투 세동맥 (17)의 photothrombotic 폐쇄를 활용하고있다. 이러한 모델은 각각 장단점 5를 모두 갖는다. 현재 기술 모델은 축삭 이상 손실, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN 및 MDD는 NIH K08 NS083740과 신경의 UCLA 부서의 지원을 받았다. AJG는 박사 미리 암과 셀던 아델슨 G. 의학 연구 재단과 래리 L. Hillblom 재단의 지원을 인정합니다. KLN은 기꺼이 미국 심장 협회 14BFSC17760005 ASA-Bugher 뇌졸중 센터에서 지원을 인정합니다. ILL, EGS와 STC는 NIH R01 NS071481에 의해 지원되었다. JDH는 NIH K08 NS083740의 지원을 인정합니다.
Materials
| L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride | Calbiochem | 400600-20MG | |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical, Inc. | NDC 57319-559-06 | |
| Capillary tubes | World Precision Instruments | 50-821-807 | |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | Picospritzer II | |
| Stereotactic setup | Kent Scientific | KSC51725 | |
| Pipette puller | KOPF | Model 720 | |
| Stereomicroscope SZ51 | Olympus | 88-124 | |
| Fine scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8547 | |
| Curved Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8598 | |
| Blunt dissection tool | Fine Scientific Tools | 10066-15 | |
| Drill | Dremel | 8220-1/28 | |
| Drill bits | Fine Scientific Tools | 19007-05 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Marcaine | HOSPIRA | NDC 0409-1610-50 | |
| Trimethoprim-Sulfamethaxole | STI Pharmacy | NDC 54879-007-16 | |
| Fluororuby | Fluorochrome Inc | 30mg | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | |
| Sucrose | Fisher | BP220-10 | |
| Cryostat | Leica CM3050 S | 14047033518 | |
| Glass slides | Fisher | 12-544-7 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| 23 gauge butterfly needle | Fisher | 14-840-35 | |
| 10X Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14065056 | |
| 1M HEPES-KOH, pH 7.4 | Affymetrix | 16924 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Cyclohexamide | Sigma | 01810 |
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