En allsidig Murine modell av Subkortikal hvit substans Stroke for studier av aksonal degenerasjon og hvit substans nevrobiologi

Summary

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Abstract

Hjerneslag rammer hvit substans utgjør opptil 25% av kliniske slag presentasjoner, oppstår stille til priser som kan være 5-10 ganger større, og bidrar vesentlig til utviklingen av vaskulær demens. Få modeller av fokus hvit substans slag finnes, og denne mangelen på egnede modeller har hemmet forståelse av neurobiologic mekanismene som er involvert i skade respons og reparasjon etter denne type slag. Den største begrensningen av andre subkortikale takts modellene er at de ikke fokalt begrense infarkt til den hvite saken eller har primært blitt validert i ikke-murine arter. Dette begrenser muligheten til å bruke det store utvalget av murine forskning verktøy for å studere nevrobiologi av hvit substans hjerneslag. Her presenterer vi en metode for pålitelig produksjon av et samlings slag i murine hvit substans ved hjelp av en lokal injeksjon av en irreversibel eNOS inhibitor. Vi presenterer også flere varianter av den generelle protokollen inkludert to unike stereovariasjoner, retrograd neuronal sporing, samt merking frisk vev og disseksjon som i stor grad utvide den potensielle anvendelser av denne teknikken. Disse variasjonene kan flere fremgangsmåter for å analysere neurobiologic virkningene av denne felles og studerte form av slag.

Introduction

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

Protocol

Bruk av dyr i denne protokollen er utført i henhold til prosedyrer godkjent av University of California Los Angeles Animal Care og bruk komité. Merk: Begynn med å identifisere målet murine befolkningen. I tidligere studier, har bare hann vill type C57 / BL6 mus blitt brukt, men forskjellige transgene eller knockout-mus kan også brukes. Merk at stereotaktiske koordinater er basert på C57 / BL6 anatomi. Det anbefales at hver bruker i utgangspunktet bekrefte lokalisering av hjerneslag til…

Representative Results

Ved hjelp av modellen presentert, kan den hvite substansen liggende forbena sensorisk cortex pålitelig være målrettet. Dette kjemisk induserte slagmodell, produserer fokal aksonal og myelin tap, astrocytosis, og microgliosis (figur 1), slik det er typisk sett i humane lakunære infarkter. Ved å bruke tre injeksjoner, er en klinisk nyttig modell etablert med tidlig verdifall på forbena motoriske oppgaver 7 og en liten, men signifikant del av hjernevevet er…

Discussion

Et antall tidligere modeller av subkortikal slag er blitt beskrevet blant annet brenn injeksjoner av endotelin-1 i den interne kapselen, subkortikal hvit substans og striatum hos rotte og mus ^{12-14 6,15.} Nyere modeller av små brenn slag har benyttet kolesterol microemboli injeksjon i halspulsåren ¹⁶ og photothrombotic okklusjon av en enkelt trengende arteriole ^17. Hver av disse modellene har både fordeler og ulemper ^5. Den beskrevne modellen gir en lesjon som har…

Materials

L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810