En mångsidig Murina Modell av subkortikala vita substansen Stroke för studien av axonal degeneration och vit substans neurobiologi

Summary

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Abstract

Stroke drabbar vita substansen står för upp till 25% av kliniska stroke presentationer sker tyst vid hastigheter som kan vara 5-10 gånger högre, och bidrar i hög grad till utvecklingen av vaskulär demens. Några modeller av fokal vit substans stroke finns och denna brist på lämpliga modeller har hämmat förståelsen av de neurobiologic mekanismer som är involverade i skador respons och reparation efter denna typ av stroke. Den största begränsningen av andra subkortikala stroke modeller är att de inte fokalt begränsar infarkten till den vita substansen eller har huvudsakligen validerats i icke-murina arter. Detta begränsar förmågan att tillämpa den breda variationen av murina forskningsverktyg för att studera neurobiologi vita substansen stroke. Här presenterar vi en metod för tillförlitlig produktion av en fokal stroke hos mus vit substans med hjälp av en lokal injektion av en irreversibel eNOS-hämmare. Vi presenterar också flera varianter på det allmänna protokollet inklusive två unik stereotaktiskvariationer, bakåtsträvande neuronala spårning, liksom färsk vävnad märkning och dissekering som kraftigt utöka de potentiella tillämpningar av denna teknik. Dessa variationer tillåter flera metoder för att analysera neurobiologic effekterna av denna gemensamma och understudied form av stroke.

Introduction

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

Protocol

Användningen av djur i detta protokoll har utförts i enlighet med de förfaranden som godkänts av University of California Los Angeles Animal Care och användning kommittén. Obs: Börja med att identifiera målet murina befolkningen. I tidigare studier har endast manliga vildtyp C57 / BL6-möss använts, dock olika transgena eller knockout-möss kan även användas. Observera att stereotaktiska koordinaterna är baserade på C57 / BL6 anatomi. Det rekommenderas att varje användare förs…

Representative Results

Med hjälp av modellen presenteras kan den vita substansen underliggande forelimb sensomotoriska cortex tillförlitligt riktas. Detta kemiskt inducerade stroke modell producerar fokal axonal och myelin förlust, astrocytosis och microgliosis (figur 1), som typiskt sett i humana lakunära infarkter. Genom att använda tre injektioner, är en kliniskt användbar modell upprättas med tidig försämring på forelimb motor uppgifter 7 och en liten men betydande de…

Discussion

Ett antal tidigare modeller av subkortikal stroke har beskrivits inkluderande fokala injektioner av endotelin-1 i den inre kapseln, subkortikal vit substans och striatum på råtta ^12-14 och mus ^6,15. Nyare modeller av små kontaktpunkter stroke har utnyttjat kolesterol microemboli injektion i halspulsådern ¹⁶ och photothrombotic ocklusion av en enda genomträngande arteriole ^17. Var och en av dessa modeller har både fördelar och nackdelar ^5. Den nu beskrivna mod…

Materials

L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810