خلية الفحص مجاني لدراسة لونين Decondensation في نهاية الانقسام
Summary
The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
Abstract
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Introduction
القيطم المورق استخراج البيض هو أداة قوية والتطبيقية على نطاق واسع لدراسة الأحداث الخلوية المعقدة في بساطة مقايسة خالية من الخلايا. منذ أول وصف من قبل Lohka وMasui 1 كانت قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة العمليات الإنقسامية مثل لونين التكثيف 2، والتجمع المغزل 3، المغلف انهيار النووي 4، ولكن أيضا وسائل النقل نووي هيولي 5 أو 6 تكرار الحمض النووي. الأحداث الجارية في نهاية الانقسام، اللازمة لإعادة تشكيل نواة interphasic مثل إصلاح الغلاف النووي والمسام النووي إعادة التجميع المعقدة هي أقل بكثير يفهم مقارنة أحداث الإنقسامية في وقت مبكر ولكن يمكن دراستها على نحو مماثل باستخدام القيطم استخراج البيض 7. أنشأنا مؤخرا مقايسة على أساس القيطم استخراج البيض لدراسة ونين decondensation في نهاية الانقسام 8، وهي عملية التحقيق في إطار ذلك ينتظر طنهاية الخبر توصيف مفصل.
في metazoans، ويتم تكثيف لونين للغاية في دخول الإنقسامية من أجل القيام بأمانة الفصل بين المادة الوراثية. للتأكد من أن لونين يمكن الوصول إليها للتعبير عن الجينات وتكرار الحمض النووي أثناء الطور البيني، فإنه يحتاج إلى أن إلغاء ضغط في نهاية الانقسام. في الفقاريات، لونين هو ما يصل إلى خمسين ضعفا أكثر كبس خلال الانقسام مقارنة البيني 9، على النقيض من الخمائر حيث الضغط الإنقسامية عادة ما يكون أقل من ذلك بكثير، على سبيل المثال، فقط شقين في S. الخباز 10. وقد الفقاريات لونين decondensation درس معظمهم في سياق إعادة تنظيم DNA الحيوانات المنوية بعد الإخصاب البيض. A الآلية الجزيئية، التي nucleoplasmin، وهو بروتين الخلية البيضية وفيرة، ويتبادل protamines الحيوانات المنوية محددة لالهستونات H2A وH2B المخزنة في البيض. تم توضيح هذه العملية أيضا باستخدام القيطم استخراج البيض 11 و 12. ومع ذلك، فإن التعبيرمن nucleoplasmin يقتصر على البويضات 13 و ونين الإنقسامية لا تحتوي على هذه protamines الحيوانات المنوية الخاصة. لذا لونين decondensation في نهاية الانقسام هو nucleoplasmin مستقلة 8.
لفي المختبر decondensation رد فعل ونحن توظيف استخراج الناتجة عن تنشيط X. البيض المورق وتجمعات لونين عزل من خلايا هيلا متزامنة. علاج البيض مع حامل الأيون الكالسيوم يحاكي إطلاق الكالسيوم في البويضة الناتجة عن دخول الحيوانات المنوية أثناء الإخصاب. موجة الكالسيوم مشغلات استئناف دورة الخلية والبيضة، الذي اعتقل في الطورية الثانية من الانقسام الاختزالي، يتقدم إلى البيني الأول 14. ولذلك، مقتطفات البيض إعداد النموذج تنشيط البيض تمثل الإنقسامية الدولة مخرج / البيني وهي المختصة للحث على أحداث محددة للخروج الإنقسامية مثل decondensation لونين، المغلف النووي والمسام إصلاح معقدة. لعزل الفصل الإنقساميةromatin مجموعات استخدمنا صيغة معدلة بشكل طفيف من البروتوكول التي نشرتها جاسر وLaemmli 15، حيث يتم الإفراج مجموعات كروموسوم التي تحلل من خلايا هيلا متزامنة في الانقسام ومعزولة في البوليامين تحتوي على مخازن من قبل centrifugations الانحدار.
Protocol
Representative Results
Discussion
القيطم المورق مقتطفات البيض هي أداة مفيدة جدا لإنتاج بأمانة العمليات الخلوية في المختبر، وكان يستخدم هذا النظام بنجاح في توصيف دورة الخلية وانقسام الخلية أحداث 2، 3،5،6،17. ونظرا إلى مخازن كبيرة من المكونات النووية المحجوزة في البيض خلال oogenesis وع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الألمانية للبحوث وERC (AN377 / 3-2 وCHROMDECON 309528 لWA) وعلى زمالة الدكتوراه من بورنغير إنغلهايم فون إلى AKS الشكل 1 و 2 وأعيد طبعه من التطور الخلوي 31 (3)، Magalska وآخرون، وظيفة ATPases RuvB تشبه في لونين decondensation في نهاية الانقسام، 305-318، 2014 بعد الحصول على اذن من السيفير.
Materials
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
| 50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
| 0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
| flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
- Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
- Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
- Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
- Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
- Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
- Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
- Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
- Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
- Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
- Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
- Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
- Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
- Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
- Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
- Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).
