一种无细胞体系检测方法用于研究有丝分裂末期染色质去凝集过程

摘要

染色体高度凝缩的有丝分裂染色质去凝缩的分子机制尚不明确。我们提出一种基于从HeLa细胞分离的有丝分裂染色质簇建立的无细胞检测方法 Xenopus laevis 能够真实重建解凝过程的卵提取物 体外.

摘要

在脊椎动物细胞周期中，染色质经历广泛的结构与功能变化。进入有丝分裂期时，染色质高度凝缩为棒状染色体，并由有丝分裂纺锤体装置独立移动。有丝分裂期间的染色质凝缩使染色体的致密程度比间期增加约五十倍。在退出有丝分裂时，染色体必须重建其功能性的间期状态，该状态由核膜包被，并具备进行DNA复制和转录的能力。染色质去凝缩过程在形态学上已有较清晰的描述，但在分子层面仍知之甚少：我们目前缺乏对潜在分子事件的了解，以及在很大程度上仍不清楚参与该过程的因子及其调控机制。本文描述了一种无细胞体系，能够真实地重现染色质去凝缩过程 体外，基于从同步化的HeLa细胞中纯化的有丝分裂染色质簇 X. laevis 卵提取物。我们的无细胞体系为进一步在分子水平上表征染色质去凝集及其与有丝分裂退出过程中同步发生的其他事件（如核膜和核孔复合体的重新组装）之间的协调机制提供了重要工具。

引言

Xenopus laevis 卵提取物是一种强大且广泛应用的工具，可在无细胞体系的简化条件下研究复杂的细胞事件。自 Lohka & Masui¹首次描述以来，该体系已被广泛用于研究有丝分裂过程，如染色质凝缩²、纺锤体组装³、核膜破裂⁴，以及核质运输⁵或DNA复制⁶。相比之下，有丝分裂末期发生的、对间期细胞核重建至关重要的事件，如核膜重建和核孔复合体的重新组装，其机制尚不清楚，但同样可利用Xenopus卵提取物进行研究⁷。我们近期建立了一种基于Xenopus卵提取物的实验方法，用于研究有丝分裂末期的染色质去凝缩过程⁸，这一过程尚未得到充分研究，有待深入表征。

在多细胞动物中，染色质在进入有丝分裂时高度凝缩，以确保遗传物质能够准确分离。为了保证在间期染色质可被基因表达和DNA复制所利用，必须在有丝分裂末期使其去凝缩。在脊椎动物中，有丝分裂期的染色质凝缩程度相比间期可高达五十倍 ⁹与酵母中通常低得多的有丝分裂压缩程度相比， 例如， 仅两倍于 S. cerevisiae ¹⁰脊椎动物染色质去凝集的研究主要集中于卵子受精后精子DNA的重组过程。其分子机制涉及核质素（nucleopl....

方案

HeLa 细胞有丝分裂染色质聚集体的分离

1. 准备工作

1. 细胞培养溶液
   1. 通过向DMEM中添加10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM谷氨酰胺，制备完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。用去离子水配制磷酸盐缓冲液（PBS），其中含2.7 mM KCl、137 mM NaCl、10 mM Na₂HPO₄·2H₂O和2 mM KH₂PO₄，并用10 N NaOH将pH调节至7.4。
      注意：PBS可长期在室温下保存为10倍浓缩液。使用前用去离子水稀释至1倍浓度。若用于细胞培养，使用前需再次过滤1倍溶液。
   2. 用DMEM培养基配制40 mM胸苷溶液（适用于细胞培养）储备液。将0.97 g胸苷溶解于90 mL DMEM培养基中，定容至100 mL。将储备液储存在-20 °C。将诺考达唑溶解于DMSO中，配制成5 mg/mL的储备液（注意！在通风橱内操作，佩戴手套和口部防护装备）。
2. 有丝分裂簇分离溶液
   注意：1.2中所述所有溶液在配制或解冻后，整个实验过程中均需保持在冰上。 ....

结果

解凝聚反应的时间依赖性

图1 显示了染色体去凝集实验的典型时间过程。反应开始时可见的染色体簇逐渐去凝集，并融合成一个单一、圆形且表面光滑的细胞核。当用蔗糖缓冲液替代卵母细胞提取物时，染色体簇仍保持凝集状态，这表明去凝集活性存在于卵母细胞提取物中。

染色质去凝集是一个依赖能量的过程

该 体外 去凝聚反应可被方便地操控 例如， 通过添加抑制剂。在下图所示的实验中 图2，不可水解的ATP或GTP类似物，ATPγS 或 GTPγS 被加入反应体系中，两者均抑制了解聚过程，表明该过程是依赖 ATP 和 GTP 的主动过程（图2).

染色质去凝集与核膜重建可被分离

在有或无膜存在的情况下进行了染色质去凝缩实验.......

讨论

Xenopus laevis 卵母细胞提取物是真实再现细胞过程的非常有用的工具 体外，并且该系统已成功用于细胞周期和细胞分裂事件的表征 ^2,3,5,6,17由于在卵子发生过程中卵细胞内储存了大量细胞核组分，因此卵提取物是获取细胞成分的优良来源。与哺乳动物组织细胞系中的RNA干扰或遗传操作等其他方法相比，该系统具有多项优势：无细胞体系可使研究者在不受细胞存活性限制的情况下研究细胞过程；此外，复杂过程中的各个独立步骤亦可通过简单的实验体系进行分析。本文所介绍的染色质去凝集实验，可特异性地研究有丝分裂后染色质去凝集的分子机制，且不受其他有丝分裂事件的干扰。 非洲爪蟾 卵母细胞提取物易于通过去除特定蛋白质以及添加抑制剂或突变蛋白进行操作 ⁸例如， 图2 显示了在去凝集实验中加入不可水解的ATP或GTP类似物ATPγS和GTPγS的结果。通过稀释和差速离心法 非洲爪蟾 卵子组分（如膜和胞质溶胶）可以被分离 ¹⁶. 图3 显.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亚精胺四盐酸盐	Fluka analytical	85610-25G
精胺三盐酸盐	Sigma	S2501-5G
高纯度皂苷	Millipore	300410-1GM	有毒
PMSF	Applichem	A0999,0100	有毒
胸腺嘧啶	Calbiochem	6060
诺考达唑	Calbiochem	487928	有毒
37% 甲醛溶液	Roth	7398-1	有毒
台盼蓝溶液 (0.4%)	Sigma	T8154	有毒
1,4-二硫苏糖醇 (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF 盐酸盐	Applichem	A1421,0001
胃蛋白酶抑制剂	Roth	2936.1/2/3
亮抑蛋白酶肽	Roth	CN334
抑肽酶	Roth	A162.3
Percoll（胶体二氧化硅颗粒溶液）	GE Healthcare	17-0891-01
谷氨酰胺	Gibco	25030-024
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
75 cm² 组织培养瓶	Greiner Bio-one	658175
热灭活胎牛血清 (FBS)	Gibco	10500-064
匀浆器 (40 ml 组织研磨器)	Wheaton	357546
血细胞计数板（Neubauer 计数室）	Assistent	441/1
橡树岭离心管，聚碳酸酯材质 (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm 细胞筛，尼龙材质	BD Falcon	352360
细胞松弛素 B	Applichem	A7657,0010	有毒
放线菌酮	Roth	8682.3	有毒
L-半胱氨酸	Merck	1,028,381,000
人绒毛膜促性腺激素 (hCG)，商品名 Ovogest	MSD	1431593
孕马血清促性腺激素 (PMSG)，商品名 Intergonan	MSD	1431015
A23187（钙镁混合盐）	Enzo	ALX-450-002-M010	有毒
注射器针头 (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
磷酸肌酸二钠盐	Calbiochem	2380
肌酸磷酸激酶	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
多聚甲醛 (PFA)	Sigma	P-6148	有毒
TLA 100 用离心管 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver"（带宽口吸头，1,000 µl）	Biozym	729065
50% 戊二醛溶液，I 级	Sigma alderich	G7651-10 ml	有毒
0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸溶液	Sigma	P8920-100 ml
平底管 (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield 封片剂	Vector laboratories	H1000
TLA120 用离心管 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver"（带宽口吸头，200 µl）	Biozym	729055
12 mm 盖玻片	Thermo Scientific	0784 #1