Das funktionale Verhalten der Zellen in Kultur können -ähnlichen 3-dimensional Kulturumgebungen 16-21 in mehr in vivo durch Züchten verbessert werden. Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und den Betrieb eines Hohlfaser – Bioreaktor – System für In – vivo – -ähnlichen Säugetiergewebekultur.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
Gewebekultur ist eine etablierte Technik für das Wachstum und / oder die Wartung von Zellen , die 1,2 seit über 100 Jahren verwendet worden. Die Bequemlichkeit des Studierens Zellen und Antworten ex vivo Experimenten hat weitreichende Vorteile , so dass die sonst sehr schwierig sein würde , wenn nicht unmöglich, beispielsweise die Erzeugung gentechnisch veränderter Zellinien und die Verwendung von Reporterzellen in Hochdurchsatzscreening – Assays 3. In jüngerer Zeit Gewebekultur hat zu dem Gebiet des Tissue Engineering gegeben, für die Erzeugung von in vitro – Modellen und regenerative Medizin. Mit diesen Anwendungen Interesse an dynamischen 3-dimensionale (3D) Kultursysteme ist deutlich gewachsen.
3D – Kulturmethoden (hier definiert als 3D – Kultursubstrat und / oder die Einführung von dynamischen Richtungsfluss) besser rekapitulieren die Architektur der in vivo zellulären Umgebung, wichtig für eine Erreichungphysiologischere artige Funktion. Die Fähigkeit, zu extrahieren, zu wachsen, zu differenzieren und Transplantation Zellen mit dem Ziel, kranken und beschädigtes Gewebe zu reparieren ist ein Bereich der Studie, die ein großes Potenzial für Patienten Nutzen und kommerziellen Chancen hat. Beispielsweise die Verwendung von autologer Keratinozyten zur Behandlung von Verbrennungen (siehe 4) und die Verwendung von zellbasierten Therapien zur Behandlung von Schlaganfall (siehe 5). Ebenso erstreckt sich der Markt für in – vitro – Modellen der Wirkstoffforschung zu geschichtete medizinische Anwendungen. Die Konvention in der Gewebekultur ist das Wachstum von adhärenten oder Verankerung abhängige Zelltypen auf dem 2-dimensionalen (2D) Oberfläche einer Gewebekulturflasche. Während derzeit als Goldstandard in einem Forschungs Einstellung akzeptiert, hat kürzlich Interesse an der Tissue – Engineering – Anwendungen die Tatsache hervorgehoben , dass die aktuellen 2D – Gewebekulturumgebung für die erforderliche Scale-up in der Zellproduktion 6 unzureichend ist.
Für adhärenten Zelltypen eine scaffold ist erforderlich, die auf Endanwendung variieren je, sowohl in Bezug auf die chemische Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften. Einige Systeme verwenden Gerüste sowie Platteneinsätzen aus hochporösen Matrix , die aus hohen inneren Phasenemulsion Templat gebildet (siehe 7) oder elektrogesponnenen Fasern (siehe 8) mit minimaler Anpassung von herkömmlichen 2D – Kulturtechniken. Die Zellen können auf Mikroträgern unterschiedlicher Zusammensetzung ausgesät werden und in Rührkessel gezüchtet , das 9 Nährstoffen und Signalmoleküle und wegtragen Abfallprodukte (Massentransport) durch eine dynamische und gemischte Umgebung liefern. Jedoch sind diese Systeme in ihrer in vivo -ähnlichen Umgebung beschränkt und weitere Verbesserungen hinsichtlich Kosten hergestellt werden maßstäblich-up. Hohlfaser – Bioreaktoren (HFBS) sind eine 3D – Kultursystem , das mit Zellen von Fasern in ein Modul befestigt bestehen typischerweise an der Außenseite der porösen Fasern ausgesät und Medien durch die Faserlumen abgegeben (Übersicht in 10) (Abbildung 1). HFBS bieten eine in vivo -ähnlichen Umgebung mit den Fasern Blutkapillaren und Abschirmen der Zellen von den Scherspannungen , die mit dynamischen Medienzuführungs nachahmt, während gleichzeitig definierten Scher an Zellen die über eine Fluidströmung durch die Seitenanschlüsse angelegt werden , falls gewünscht. Dies schafft eine vielseitige Kultursystem mit überlegenen Massentransport in dem hohe Zelldichten 11 erreicht werden kann. Das HFB – System ist gut geeignet für die Pflege von verankerungsabhängigen Zelltypen und wurde zur Kultur eine Vielzahl von Zellen , einschließlich Rattenpankreas Langerhans'schen Inseln 12, Maus β-TC-3 – Insulinom – Zelllinie 12, primäre humane Hepatozyten 13, menschlichen Knochen verwendet worden , marrow mononukleären Zellen 14, Madin Darby Hundenierenzellen (MDCK) 15 und Caco-2 – Zellen 16 ein paar zu nennen.
Zusätzlich zu den Systemvorteile der Massentransfer und Scale-up, gezüchteten Zellen in 3D tissue Kultursysteme sind in der Regel in vivo -like in Morphologie und stärker auf experimentelle Hinweise zu sein. Beispielsweise Ratten primären Hepatozyten zeigen eine quaderförmige Morphologie, erhöhte Lebensfähigkeit, größere Induktion von Cytochrom-P450 – Enzymaktivität und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Paracetamol Toxizität , wenn sie in einem handelsüblichen Polystyrolgerüst Vergleich zu Zellen in Kultur 2D 17 angebaut. Mit dem gleichen Gerüst der hepatocarcinoma Zelllinie auch eine zu erhöhen Albuminproduktion 18 und zeigen in vivo -ähnlichen Reaktion auf Methotrexat im Vergleich zu 2D – kultivierten Zellen 19 gezeigt HepG2 wurde. Primäre humane Hepatozyten zeigten verzögerte Entdifferenzierung, höhere Cytochrom-P450 – Aktivität und erhöhte Clearance für 4/5 Verbindungen in einem Perfusionskultursystem getestet 20. Menschliche neurale Stammzellen abgeleiteten Neuronen und Glia kultiviert in einem handelsüblichen Polystyrolgerüst zeigten beide hoch (Aktionspotential) und Nieder frequency (lokale Feldpotential) spontane Aktivität während keine wurde die neuronale Aktivität in den 21 kultivierten Zellen 2D nachgewiesen. Caco-2 – Zellen zeigten eine verbesserte Differenzierung in einer HFB Vergleich zu 2D – Kultur durch erhöhte alkalische Phosphatase gemessen, γ-Glutamyltransferase und P-Glycoprotein – Aktivität und eine höhere Expression von F-Actin und zona occludens-1 – Protein 16. Trotz der Vorteile, andere die Routine Kultivierung von Zellen in Systemen als eine 2D-Gewebekulturflasche Oberfläche ist immer noch nicht in vielen Labors praktiziert wird, obwohl die Anzahl von Veröffentlichungen zitiert 3D-Zellkultur wächst (8-fachen Anstieg in den letzten 10 Jahren. Quelle : PubMed Werkzeug "Ergebnisse von Year 'sondiert mit" 3D-Kultur ").
Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und Betriebsbedingungen eines HFB System für Säugerzellkultur und zeigt ihre Nützlichkeit der hepatocarcinoma HepG2 / C3A in die Kultivierung. Das Ziel dieser Methode ist es, die Zellen in Kultureine in vivo -ähnlichen Kultursystem , das genügend Einfachheit behält , um sie zugänglich neue für diejenigen, die auf 3D – Kultursystemen. Das Grundprinzip hinter HFBS in der Anwendung beschreiben hier, was die Vorhersagbarkeit der Leber Modelle zu verbessern , ist , dass es theoretisch möglich ist , eine hepatische sinusoid innerhalb der HFB – Umgebung 22 zu imitieren. Dies ist derzeit nicht möglich, mit anderen Kultursystemen.
Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und den Betrieb eines Hohlfaser-Bioreaktor (HFB) System für Säugetierzellkultur und ihre Nützlichkeit in wuchernden die Hepatozyten-Zelllinie HepG2 / C3A demonstriert. Das System ist auf dem Regal eines Standard-Inkubator und seine Set-up zu passen ist einfach genug, um von einer zuständigen Zellbiologe vertraut mit aseptischer Technik durchgeführt werden.
Die Fasern in der Forschungssystem verwendet hier beschriebenen in Haus durch Phaseninversions Schleuderguß (Spinnen) hergestellt, das eine nicht-bioabbaubare proprietären Polymer verwendet. Es ist möglich, Fasern zu bilden, indem aus einer Vielzahl von geeigneten Materialien für die Zellkultur Spinn sowohl biologisch abbaubare und nicht biologisch abbaubar, beispielsweise; Polycaprolacton (PCL) 27, Poly-L-lactid Säure (PLLA) 28, Poly (milch-co-glykolsäure) (PLGA) 29, Polysulfon (PSU) 12 und Polyetheretherketon (PEEK) 13. Jeder hat unterschiedliche Eigenschaften einnd sollte basierend auf den Bedürfnissen des Systems gewählt werden. Überprüfen Sie die Kompatibilität der verwendeten Faser mit dem Ethanol in der Sterilisationsschritt verwendet wird. PLGA ist bekannt , mit Ethanol erfordert eine alternative Behandlung , wie Antibiotika / Antimykotika – Lösung 25 bis plastifizieren.
Die Abmessungen der Glasmodule hier verwendet wurden, basierend auf den Anforderungen der aktuellen Forschung ausgewählt. Verschiedene Größen können von jedem seriösen Glasbläserei hergestellt werden. Eine Betrachtung in Modulgröße ist die Anzahl der Zellen, die auf die Anzahl der Fasern in dem Modul und wahrscheinlich Strömungsraten verbunden ist. Je mehr Zellen gibt es in dem Modul je höher die Strömungsraten, um sein müssen am Ausströmende des Bioreaktors günstige Kulturbedingungen zu halten. Dies wird eine Grenze, wie irgendwann erreichen und einige Versuch und Irrtum kann mit der Überwachung von Medienbedingungen im Modul Permeat erforderlich. Mathematische Modellierung kann einige Einblicke in die gewünschte Modul Dimen bietensionen und Strömungsgeschwindigkeiten 22.
Die Abmessungen der Vorrichtung hier verwendet wird, ausgelegt auf einen Inkubator Regal zu passen. Die Länge des Rohres wird durch die Länge diktiert, während auch ermöglicht genügend Bewegung von Komponenten für die Einrichtung und den Betrieb zwischen den Anschlüssen zu ermöglichen, benötigt zu erreichen. Wenn Zeitverlauf Abtastung erforderlich ist, beispielsweise bei der Überwachung von Medienbedingungen in dem Modul durchdringen kann Einblasöffnungen zum Retentat zugegeben werden und Permeatleitungen dies zu erleichtern.
Eine Voraussetzung für jede Zellkultursystem ist wachsende Zellen am Leben und in den meisten Fällen zu halten. Im Lichte der Studien eine in vivo -ähnlichen Phänotyp in Zellen gewachsen in 3D – Kultursystemen demonstrieren scheint es auch wichtig , eine Umgebung zu schaffen , die eng an die in vivo – Umgebung durch die Zellen angetroffen nachahmt. Dieser letzte Punkt wird häufig in 2D-Zellkultur zugunsten der Einfachheit halber wird dieser Kultursystem bietet vernachlässigt. Ter HFB – Mimetika in vivo Kapillarnetzwerke von Nährstoffen zu den Zellen durch das Lumen der Fasern liefert. Die Abfallprodukte werden ebenfalls von dem System durch den dynamischen Strom entfernt. Dadurch entsteht ein in vivo -ähnlichen System für die Zellkultur und einer, die in vivo – Umgebung eng nachahmt von Hepatozyten zu sehen ist , dieses System eine bessere Wahl zu machen im Vergleich zu Kulturkunststoff 2D – Gewebe für diese Zellen kultiviert werden . Dies wird durch die Tatsache untermauert, die Zellen sezer 15-fachen der Menge an Albumin, eine wichtige Leberfunktion, in der HFB Kultursystem im Vergleich zu denen auf Kulturkunststoff 2D-Gewebe gezüchtet.
Während das HFB – System die meisten , wenn nicht alle Verankerung abhängige Zelltypen geeignet ist, ist das Beispiel hier für Hepatozyten , weil es einen echten Bedarf an Kultur zu können ist funktionell, mehr in vivo -ähnlichen Hepatozyten für die Verwendung in der Arzneimittelentwicklung von der Pharmaindustrie und in bioartifiziellen Leber Geräte für die extrakorporale Unterstützungvon Leberversagen Patienten. Der Bedarf an funktioneller Zellen erstreckt sich über diese Beispiele, insbesondere auf dem Gebiet der regenerativen Medizin in eine Phase der translationalen Arbeit eintritt. Die Vorteile einer in – vivo – -ähnlichen Kulturumgebung sollte nicht übersehen werden.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |