يمكن تحسين السلوك الوظيفي للخلايا في الثقافة عن طريق زراعة في أكثر في الجسم الحي تشبه البيئات الثقافة 3-الأبعاد 16-21. توضح هذه المخطوطة انشاء وتشغيل نظام الألياف مفاعل حيوي جوفاء في الجسم الحي تشبه الثدييات زراعة الأنسجة.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
زراعة الأنسجة هي تقنية أنشئت لنمو و / أو صيانة الخلايا التي تم استخدامها لأكثر من 100 سنة 1،2. راحة دراسة الخلايا والاستجابات خارج الحي وبعيدة المدى مزايا السماح التجارب التي من شأنها أن يكون الأمر خلاف ذلك صعبة للغاية إن لم يكن مستحيلا، على سبيل المثال جيل من خطوط الخلايا المعدلة وراثيا واستخدام الخلايا مراسل في عالية الإنتاجية المقايسات فحص 3. وفي الآونة الأخيرة أعطت زراعة الأنسجة يؤدي إلى مجال هندسة الأنسجة، لتوليد نماذج في المختبر والطب التجديدي. مع هذه التطبيقات، وتنامى الاهتمام في نظم ثقافة ديناميكية 3 الأبعاد (3D) إلى حد كبير.
أساليب الثقافة 3D (المعرفة هنا باعتبارها الركيزة ثقافة 3D و / أو إدخال تدفق الحيوية الاتجاه) أفضل تلخيص بنية في الجسم الحي البيئة الخلوية، مهمة لتحقيقالمزيد الفسيولوجية مثل وظيفة. القدرة على استخراج، وتنمو، تمييز وخلايا الزرع بهدف إصلاح الأنسجة المريضة والتالفة هي مجال الدراسة أن لديها امكانات ضخمة لصالح المرضى والفرص التجارية. على سبيل المثال استخدام الخلايا الكيراتينية ذاتي لعلاج الحروق (انظر 4) واستخدام العلاجات القائمة على الخلايا لعلاج السكتة الدماغية (انظر 5). وبالمثل، فإن السوق لنماذج في المختبر يمتد اكتشاف المخدرات إلى تطبيقات الطب الطبقية. الاتفاقية في زراعة الأنسجة هو نمو أنواع الخلايا تعتمد ملتصقة أو مرسى على (2D) سطح 2-الأبعاد من قارورة زراعة الأنسجة. بينما المقبولة حاليا كمعيار الذهب في إعداد البحوث، وقد أبرزت الاهتمام الأخيرة في تطبيقات هندسة الأنسجة حقيقة أن بيئة زراعة الأنسجة 2D الحالية غير كافية لحاجة النطاق حتى في إنتاج خلايا 6.
لأنواع الخلايا الملتصقة على scaffolمطلوب د، والتي سوف تختلف اعتمادا على الاستخدام النهائي، سواء من حيث التركيب الكيميائي والخواص الميكانيكية. بعض النظم تستخدم السقالات وكذلك لوحة إدراج تتكون من مصفوفة المسامية العالية شكلت من ارتفاع النموذجيه المرحلة مستحلب الداخلي (انظر 7) أو الألياف electrospun (انظر 8) تتطلب الحد الأدنى من التكيف من تقنيات ثقافة 2D التقليدية. الخلايا يمكن المصنف على ناقل دقيق من المؤلفات متفاوتة ونمت في خزانات أثارت التي تقدم المواد الغذائية والجزيئات يشير، ونقل النفايات بعيدا (النقل الجماعي) من خلال بيئة مختلطة جيدا ديناميكية 9. ومع ذلك، فإن هذه الأنظمة محدودة في الجسم الحي تشبه البيئة ويمكن إجراء المزيد من التحسينات فيما يتعلق حجم المتابعة التكاليف. المفاعلات الحيوية الألياف المجوفة (HFBs) هي نظام الثقافة 3D التي تتكون من ألياف الثابتة في وحدة نمطية مع الخلايا عادة المصنف في الخارج من الألياف التي يسهل اختراقها وسائل الإعلام التي تنفذ من خلال تجويف الألياف (إعادة النظر في 10) (الشكل 1). HFBs نقدم في الجسم الحي تشبه البيئة مع الألياف محاكاة الشعيرات الدموية ويحمي الخلايا من اجهادات القص المرتبطة تسليم وسائل الإعلام الديناميكي، في حين يسمح القص محددة ليتم تطبيقها على خلايا عبر تدفق السوائل من خلال المنافذ الجانبية إذا رغبت في ذلك. وهذا يخلق نظاما ثقافة تنوعا مع النقل الجماعي متفوقة فيها كثافات عالية الخلية يمكن الوصول 11. النظام HFB هي مناسبة تماما للحفاظ على أنواع الخلايا تعتمد مرسى واستخدمت لثقافة مجموعة متنوعة من الخلايا بما في ذلك الفئران الجزر البنكرياسية لانجرهانز 12، β-TC-3 الماوس جزيري خط الخلية 12، خلايا الكبد البشرية الابتدائية 13، عظام بشرية خلايا نخاع وحيدات النوى 14، مادين داربي خلايا الكلى الكلبي (MDCK) 15 وكاتشو-2 خلايا 16 على سبيل المثال لا الحصر.
بالإضافة إلى مزايا نظام نقل الجماعي وزيادتها والخلايا المزروعة في 3D تيسنظم الاستزراع مقاضاة تميل إلى أن تكون أكثر في الجسم الحي تشبه في الشكل وأكثر استجابة لمنبهات التجريبية. على سبيل المثال الفئران خلايا الكبد الأولية تظهر التشكل أكثر مكعبة، وزيادة قدرتها على البقاء، أكبر تحريض نشاط انزيم السيتوكروم-P450 وزيادة الحساسية للسمية الباراسيتامول عندما نمت في سقالة البوليسترين المتاحة تجاريا مقارنة مع الخلايا المزروعة في 2D الثقافة 17. باستخدام نفس سقالة وقد تبين أيضا خط الخلية سرطانة الكبد HepG2 لزيادة إنتاج الألبومين 18 و تظهر أكثر في الجسم الحي تشبه استجابة للميثوتريكسات مقارنة 2D الخلايا المستزرعة 19. أظهرت خلايا الكبد البشرية الأساسية المتأخر فقد التمايز، وارتفاع النشاط السيتوكروم P450-وزادت إزالة ل4/5 مركبات اخضعت للاختبار في نظام الثقافة نضح 20. الخلايا الجذعية العصبية البشرية الخلايا العصبية المشتقة والدبقية مثقف في سقالة البوليسترين المتاحة تجاريا عرضت على حد سواء عالية (إمكانات العمل)، وانخفاض freque-تم الكشف عن NCY (إمكانات الميدانية المحلية) النشاط العفوي في حين لا نشاط الخلايا العصبية في خلايا 2D مثقف 21. أظهرت خلايا كاتشو-2 تعزيز التمايز في HFB مقارنة ثقافة 2D تقاس زيادة الفوسفاتيز القلوية، γ-glutamyltransferase والنشاط ف بروتين سكري وارتفاع تعبير عن F-الأكتين وزونا النطيقة-1 بروتين 16. على الرغم من المزايا، لا يزال غير تمارس زراعة الروتينية من الخلايا في الأنظمة الأخرى من سطح نسيج الثقافة قارورة 2D في العديد من المختبرات، على الرغم من أن عدد من المنشورات نقلا عن زراعة الخلايا 3D ينمو (زيادة بنسبة 8 أضعاف في السنوات ال 10 الماضية. المصدر : مجلات "النتائج حسب السنة" أداة بحث مع "ثقافة 3D ').
توضح هذه المخطوطة انشاء وظروف التشغيل من نظام HFB للثقافة خلايا الثدييات وتوضح فائدتها في زراعة خط الخلية سرطانة الكبد HepG2 / C3A. والهدف من هذه الطريقة هو ثقافة الخلايا فيوفي الجسم الحي تشبه نظام أكثر ثقافة أن يحتفظ بما فيه الكفاية البساطة لجعلها قابلة لأولئك الذين هم جديدة لأنظمة الثقافة 3D. الأساس المنطقي وراء استخدام HFBs في تطبيق يصف هنا، وهو لتحسين القدرة على التنبؤ نماذج الكبد هو أنه من الممكن نظريا لتقليد السيني الكبدي ضمن بيئة HFB 22. هذا ليس ممكنا في الوقت الراهن مع أنظمة ثقافة أخرى.
توضح هذه المخطوطة انشاء وتشغيل نظام الألياف المجوفة مفاعل حيوي (HFB) للثقافة خلايا الثدييات وأثبتت فائدتها في المتكاثرة خط الخلية الكبدية HepG2 / C3A. تم تصميم هذا النظام لتناسب على الرف من حاضنة القياسية ولها مجموعة المتابعة بسيطة بما فيه الكفاية لأن تقوم بها أي بيولوجيا الخلايا المختصة على دراية تقنية العقيم.
يتم تصنيع الألياف المستخدمة في نظام البحوث وصفها هنا في المنزل عن طريق مرحلة انعكاس تدور الصب (الغزل) باستخدام البوليمر الملكية غير القابلة للتحلل. فمن الممكن لجعل الألياف عن طريق الغزل من مجموعة متنوعة من المواد المناسبة لزراعة الخلايا، سواء القابلة للتحلل وغير القابلة للتحلل، على سبيل المثال، polycaprolactone (PCL) 27، وحمض بولي-L-lactide (PLLA) 28، وبولي (حامض اللبنيك في-ك-الجليكوليك) (PLGA) 29، متعدد السلفون (PSU) 12 وpolyetheretherketone (نظرة خاطفة) 13. كل له خصائص مختلفةالثانية ينبغي اختيار على أساس احتياجات النظام. تأكد من توافق من الألياف يعمل مع الإيثانول المستخدم في الخطوة التعقيم. ومن المعروف PLGA للين مع الإيثانول يستلزم العلاج البديل مثل المضادات الحيوية / مضاد فطري حل 25.
وقد تم اختيار أبعاد وحدات الزجاج المستخدم هنا على أساس احتياجات البحوث الحالية. أحجام مختلفة يمكن أن تقدمها أي نفخ الزجاج شركة محترمة. وهناك اعتبار في حجم الوحدة هو عدد الخلايا، الذي يرتبط عدد من الألياف في وحدة ومعدلات التدفق المحتمل. لمزيد من الخلايا وهناك في وحدة وارتفاع معدلات التدفق سوف تحتاج إلى أن تكون من أجل الحفاظ على ظروف مواتية الثقافة في نهاية تدفق مفاعل حيوي. هذا وسوف تصل إلى حد كنقطة بعض وبعض التجربة والخطأ قد يكون مطلوبا مع رصد أوضاع الإعلام في تتخلل حدة. قد توفر النماذج الرياضية بعض الأفكار في dimen الوحدة المطلوبةاالنبعاثات ومعدلات تدفق 22.
تم تصميم أبعاد جهاز يستخدم هنا لتناسب على رف الحاضنة. وأملت طول أنابيب بطول اللازمة لتصل إلى ما بين الموصلات في حين يسمح أيضا حركة ما يكفي من العناصر للسماح لانشاء وتشغيل. إذا كنت بحاجة لأخذ العينات الوقت بطبيعة الحال، على سبيل المثال في رصد أوضاع الإعلام في وحدة تتخلل ثم الموانئ حقن يمكن أن تضاف إلى retentate وتتخلل خطوط لتسهيل ذلك.
ومن الشروط الأساسية لأي نظام زراعة الخلايا هو للحفاظ على الخلايا على قيد الحياة وفي زراعة معظم الحالات. في ضوء الدراسات يدل على أكثر في الجسم الحي تشبه النمط الظاهري في الخلايا المزروعة في نظم الاستزراع 3D يبدو من المهم أيضا لتوفير بيئة الذي يحاكي عن كثب البيئة في الجسم الحي من قبل خلايا واجهتها. غالبا ما تهمل هذه النقطة الأخيرة في خلية ثقافة 2D لصالح الراحة ويوفر هذا النظام الثقافة. تانه HFB يقلد في الشبكات الشعرية الجسم الحي من خلال توفير المواد الغذائية إلى الخلايا عبر التجويف من الألياف. تتم إزالة الفضلات أيضا من النظام عن طريق تدفق الحيوية. وهذا يخلق في الجسم الحي تشبه نظام للثقافة الخلية واحد الذي يحاكي عن كثب البيئة في الجسم الحي ينظر إليها من قبل خلايا الكبد، مما يجعل هذا النظام خيارا أفضل مقارنة 2D نسيج البلاستيك الثقافة لزراعة هذه الخلايا. وهذا ما تؤكده حقيقة الخلايا تفرز 15 أضعاف كمية الزلال، وظيفة الكبد الهامة، في نظام الثقافة HFB مقارنة بتلك المزروعة في 2D البلاستيك زراعة الأنسجة.
بينما يناسب النظام HFB لمعظم إن لم يكن جميع أنواع الخلايا تعتمد مرسى، والمثال هنا هو لخلايا الكبد بسبب وجود حاجة حقيقية لتكون قادرة على ثقافة وظيفية، وأكثر في الجسم الحي تشبه خلايا الكبد لاستخدامها في تطوير الأدوية من قبل صناعة الأدوية وفي الأجهزة الكبد bioartificial للدعم خارج الجسممن الكبد مرضى الفشل. الحاجة إلى المزيد من الخلايا الوظيفية تتجاوز هذه الأمثلة، لا سيما في مجال الطب التجديدي يدخل مرحلة العمل متعدية. لا ينبغي إغفال مزايا في الجسم الحي تشبه بيئة أكثر ثقافة.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |