Il comportamento funzionale delle cellule in coltura può essere migliorata coltivando in più in vivo -come ambienti di coltura 3 dimensioni 16-21. Questo manoscritto descrive il set-up e il funzionamento di un sistema a fibra cava bioreattore per vivo -come mammiferi coltura di tessuti in.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
Coltura tissutale è una tecnica consolidata per la crescita e / o manutenzione di celle che è stato utilizzato per oltre 100 anni 1,2. La convenienza di cellule che studiano e risposte ex vivo ha vasta portata vantaggi consentendo esperimenti che altrimenti sarebbe estremamente difficile se non impossibile, per esempio la generazione di linee cellulari geneticamente e l'uso di cellule reporter high throughput saggi di screening 3. Più recentemente coltura tissutale ha dato origine al campo dell'ingegneria dei tessuti, per la generazione di modelli in vitro e per la medicina rigenerativa. Con queste applicazioni, l'interesse dinamici sistemi di coltura 3 dimensioni (3D) è cresciuto significativamente.
Metodi di coltura 3D (definiti qui come substrato coltura 3D e / o l'introduzione di flusso dinamico direzionale) meglio ricapitolare in architettura l'ambiente cellulare in vivo, importante per ottenere unpiù funzione fisiologica-like. La capacità di estrarre, crescere, differenziare e le cellule di trapianto, con l'obiettivo di riparare tessuti malati e danneggiati è un campo di studio che ha un enorme potenziale per il beneficio del paziente e l'opportunità commerciale. Ad esempio l'uso di cheratinociti autologhi per il trattamento di ustioni (vedi 4) e l'uso di terapie basate sulle cellule per il trattamento di ictus (vedi 5). Allo stesso modo, il mercato per i modelli in vitro si estende scoperta di nuovi farmaci per applicazioni di medicina stratificati. La convenzione in coltura tissutale è la crescita di tipi cellulari dipendenti aderenti o ancoraggio sul (2D) superficie di un pallone di coltura tissutale 2-dimensionale. Mentre attualmente accettato come il gold standard in un ambiente di ricerca, di recente interesse per applicazioni di ingegneria dei tessuti ha messo in evidenza il fatto che l'attuale ambiente di coltura tissutale 2D è inadeguata per lo scale-up richiesto nella produzione di celle 6.
Per i tipi di cellule aderenti un scaffolè richiesta d, che variano a seconda dell'uso finale, sia in termini di composizione chimica e le proprietà meccaniche. Alcuni sistemi utilizzano ponteggi come inserti ben piatto, comprensivi di matrice altamente porosa formata da alta template emulsione fase interna (vedi 7) o fibre elettrofilate (vedi 8) che richiedono l'adattamento minimo da tecniche di coltura convenzionale 2D. Le celle possono essere seminate su microcarriers di composizioni diverse e coltivate in vasche agitati che forniscono nutrienti e molecole di segnalazione, e portano via i prodotti di scarto (trasporto di massa) attraverso un dinamico ambiente ben miscelato 9. Tuttavia, questi sistemi sono limitati nel loro ambiente in vivo -come e ulteriori miglioramenti possono essere fatti per quanto riguarda i costi di scale-up. Bioreattori fibra cava (HFBs) sono un sistema di coltura 3D che consistono di fibre fissi in un modulo con celle tipicamente seminate all'esterno delle fibre porose e supporto fornito attraverso il lume della fibra (recensione in 10) (Figura 1). HFBs offrono un vivo ambiente -come con le fibre mimano capillari sanguigni e schermatura le cellule dagli sforzi di taglio associati media delivery dinamico, consentendo velocità definito da applicare alle cellule tramite il flusso di fluido attraverso le luci laterali, se desiderato. Questo crea un sistema di coltura versatile con trasporto di massa superiore in cui densità elevata di cellule possono essere raggiunti 11. Il sistema HFB è adatto per la manutenzione dei tipi cellulari dipendenti ancoraggio ed è stato utilizzato per la cultura varie cellule compresi ratto isole pancreatiche di Langerhans 12, β-TC-3 topo linea cellulare insulinoma 12, epatociti umani primari 13, osso umano le cellule del midollo mononucleate 14, le cellule Madin Darby canine di rene (MDCK) 15 e cellule Caco-2 16 solo per citarne alcuni.
Oltre ai vantaggi del sistema di trasferimento di massa e di scale-up, cellule coltivate in 3D tissistemi di coltura Sue tendono ad essere più in vivo -come nella morfologia e più reattivo agli stimoli sperimentali. Per esempio ratto epatociti primari mostrano una morfologia più cubica, una maggiore vitalità, una maggiore induzione di attività enzimatica del citocromo P450-e una maggiore sensibilità alla tossicità paracetamolo, se coltivate in un ponteggio di polistirene disponibile in commercio rispetto alle cellule in coltura 2D 17. Utilizzando la stessa impalcatura linea cellulare HepG2 epatocarcinoma ha anche dimostrato di aumentare la produzione di albumina 18 e mostra una più vivo -come risposta al metotrexato rispetto a cellule coltivate 2D 19. Epatociti umani primari dimostrato dedifferentiation ritardato, una maggiore attività del citocromo P450-e della clearance per 4/5 composti testati in un sistema di coltura di perfusione 20. cellule staminali neurali umane neuroni e glia derivati coltivate in un ponteggio di polistirene disponibile in commercio esposte sia alta (potenziale d'azione) e bassa frequeNCY (potenziale campo locale) attività spontanea mentre nessuna attività neuronale è stata rilevata nelle cellule in coltura 2D 21. Cellule Caco-2 hanno dimostrato una maggiore differenziazione in un HFB rispetto alla cultura 2D misurata da un aumento della fosfatasi alcalina, γ-glutamiltransferasi e l'attività P-glicoproteina e più alta espressione di F-actina e Zona occludere-1 proteina 16. Nonostante i vantaggi, la coltura di routine delle cellule in sistemi diversi da una superficie pallone di coltura tissutale 2D viene ancora praticata in molti laboratori, sebbene il numero di pubblicazioni citano coltura cellulare 3D cresce (incremento di 8 volte negli ultimi 10 anni. Fonte : PubMed 'Risultati per Anno' strumento sondato con 'la cultura 3D').
Questo manoscritto descrive il set-up e condizioni di funzionamento di un sistema HFB per colture cellulari di mammifero e dimostra la sua utilità nella coltura della linea cellulare HepG2 epatocarcinoma / C3A. Lo scopo di questo metodo è quello di coltivare le cellule inuna in vivo -come sistema più cultura che mantiene abbastanza semplice per renderlo suscettibile di coloro che sono nuovi per sistemi di coltura 3D. La logica che sta dietro all'uso HFBs nell'applicazione descrivere qui, che è quello di migliorare la prevedibilità dei modelli di fegato è che è teoricamente possibile imitare una sinusoide epatica all'interno dell'ambiente HFB 22. Ciò non è attualmente possibile con altri sistemi di coltura.
Questo manoscritto descrive il set-up e il funzionamento di un sistema a fibra cava bioreattore (HFB) per colture cellulari di mammifero e la sua utilità è dimostrata in proliferanti linea cellulare di epatociti HepG2 / C3A. Il sistema è progettato per adattarsi sul ripiano di un incubatore standard ed il suo set-up è sufficiente per essere effettuata con qualsiasi cella biologo competente conoscenza tecnica asettica semplice.
Le fibre utilizzate nel sistema di ricerca qui descritto sono fabbricati in casa da inversione di fase di spin casting (spinning) utilizzando un polimero proprietario non biodegradabile. È possibile effettuare fibre mediante filatura da una varietà di materiali adatti per coltura cellulare, sia biodegradabili e non biodegradabili, per esempio; policaprolattone (PCL) 27, acido poli-L-lattide (PLLA) 28, poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) 29, polisulfone (PSU) 12 e polietereterchetone (PEEK) 13. Ognuno ha diverse proprietà and deve essere scelto in base alle esigenze del sistema. Controllare la compatibilità della fibra impiegata con l'etanolo utilizzato nella fase di sterilizzazione. PLGA è noto per plastificare con etanolo che richiede un trattamento alternativo come antibiotico / antimicotico soluzione 25.
Le dimensioni dei moduli di vetro usati qui sono stati scelti in base alle esigenze della ricerca attuale. I formati differenti possono essere fatte da qualsiasi azienda vetro soffiato stimabile. Una considerazione dimensioni modulo è il numero di cellule, che è legata al numero di fibre nel modulo e portate probabili. Più cellule sono nel modulo della maggiori portate dovranno essere per mantenere condizioni di coltura favorevoli alla fine deflusso del bioreattore. Questo raggiungerà un limite come un certo punto e alcuni tentativi ed errori può essere richiesto con il monitoraggio delle condizioni dei media nel permeato modulo. Modellazione matematica può fornire alcune intuizioni le dimen modulo richiestesioni e portate 22.
Le dimensioni dell'apparato usato qui è stato progettato per adattarsi su un ripiano incubatore. La lunghezza del tubo è dettata dalla lunghezza necessaria per raggiungere tra i connettori consentendo anche abbastanza movimento dei componenti per consentire la configurazione e il funzionamento. Se è richiesto campionamento andamento temporale, ad esempio nel controllo delle condizioni di media nel modulo permeato poi fori di iniezione possono essere aggiunti al retentato e permeato linee per facilitare questo.
Un prerequisito per qualsiasi sistema di coltura cellulare è quello di mantenere in vita e in molti casi di crescita delle cellule. Alla luce di studi che dimostrano una maggiore in vivo -come fenotipo in cellule coltivate in sistemi di coltura 3D sembra anche importante fornire un ambiente che imita da vicino l'ambiente in vivo incontrato dalle cellule. Questo ultimo punto è spesso trascurato in coltura cellulare 2D a favore della convenienza di questo sistema la cultura offre. Tha HFB imita in reti capillari vivo fornendo nutrienti alle cellule attraverso il lume delle fibre. I prodotti di scarto vengono rimossi dal sistema dal flusso dinamico. Questo crea un vivo -come sistema per colture cellulari e uno che imita da vicino l'ambiente in vivo visto dagli epatociti, rendendo questo sistema una scelta migliore rispetto a 2D coltura tissutale di plastica per coltura di tali cellule. Ciò è confermato dal fatto che le cellule secernono 15 volte la quantità di albumina, una funzione epatica importante, nel sistema di coltura HFB rispetto a quelli coltivati in 2D plastica coltura dei tessuti.
Mentre il sistema HFB è adatto per la maggior parte se non tutti i tipi di cellule dipendenti di ancoraggio, l'esempio qui è per gli epatociti perché non vi è una reale necessità di essere in grado di cultura funzionale, più in vivo -come epatociti da utilizzare nello sviluppo di farmaci da parte dell'industria farmaceutica e nel fegato bioartificiale per il sostegno extracorporeadei pazienti con insufficienza epatica. La necessità di cellule più funzionali estende oltre questi esempi, tanto più il campo della medicina rigenerativa entra in una fase di lavoro traslazionale. I vantaggi di un ambiente più vivo in -come coltura non deve essere trascurato.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |