培養中の細胞の機能的な動作は、3次元培養環境16-21様インビボでより中で培養することによって改善することができます。この原稿は、in vivo様の哺乳動物組織培養のための中空繊維バイオリアクターシステムのセットアップと操作について説明しています。
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
組織培養物は、100年以上1,2のために利用されている細胞の増殖および/ または維持のために確立された技術です。研究細胞および応答のex vivoでの利便性がはるかに、そうでなければ不可能ではないにしても非常に困難なことであろう実験を可能にする利点に到達している、例えば、遺伝子操作された細胞株の発生と高スループットスクリーニングアッセイ3におけるレポーター細胞の使用。より最近では、組織培養は、in vitroモデルを生成するための再生医療のために、組織工学の分野に上昇を与えています。これらのアプリケーションでは、動的な3次元(3D)培養系への関心が大幅に成長してきました。
(3D培養基質および/ または方向の動的流れの導入として定義)は、3D培養法は、より良好な達成のための重要な、 インビボ細胞環境のアーキテクチャを再現しますより生理様の機能。患部や損傷を受けた組織を修復する目的で、抽出成長、分化し、移植細胞能力は、患者の利益や商業機会のための巨大な可能性を秘めている研究分野です。火傷を治療するための自己ケラチノサイトの使用(4を参照)、脳卒中の治療のための細胞ベースの療法の使用は、例えば、(5を参照)。同様に、in vitroモデルの市場は成層医学アプリケーションに薬物の発見に及びます。組織培養における規則は、組織培養フラスコの2次元(2D)表面上に付着または足場依存性細胞型の成長です。現在、研究設定におけるゴールドスタンダードとして受け入れながら、組織工学アプリケーションの最近の関心は、現在の2D組織培養環境は、セル生産6で必要なスケールアップのために不十分であるという事実を強調しています。
接着細胞タイプscaffolのためDは、化学組成および機械的特性の両方の観点から、最終用途に応じて変わるであろう、必要とされます。一部のシステムでは、従来の2D培養技術から最小の適応を必要とする(8を参照)高内相エマルションテンプレート(7を参照)または電界紡糸繊維から形成された高多孔性マトリックスからなる足場が同様にプレートインサートを採用しています。細胞は、様々な組成のマイクロキャリア上に播種し、栄養素およびシグナル伝達分子を送達攪拌槽中で増殖させ、そしてダイナミックよく混合環境9を通じて廃棄物(質量輸送)を運び去ることができます。しかしながら、これらのシステムは、それらのインビボ様環境及び更なる改善が制限され、スケールアップの費用に関して行うことができます。中空繊維バイオリアクター(HFBs)は、典型的には繊維の内腔を通して送達多孔質繊維と媒体の外側に播種した細胞とモジュールに固定繊維から成る3D培養系である(1に概説0)( 図1)。 HFBsは、必要に応じて定義された剪断側ポートを介して流体の流れを介して細胞に適用させながら、毛細血管を模倣し、ダイナミックなメディア配信に関連したせん断応力から細胞をシールド繊維を用いたin vivo様の環境を提供します。これは、高い細胞密度が11に到達することができる優れた大量輸送で汎用性の高い培養系を作成します。 HFBシステムは、足場依存性細胞型のメンテナンスに最適で、文化にランゲルハンス12、マウスβ-TC-3インスリノーマ細胞ライン12、一次ヒト肝細胞13、人間の骨のラット膵島 を含む種々の細胞使用されています。骨髄単核細胞14、マディン・ダービーイヌ腎臓細胞(MDCK)15とのCaco-2細胞16は、いくつかの名前を付けます。
物質移動およびスケールアップのシステムの利点に加えて、細胞は、3D TIS中で増殖させ訴える培養系は、形態や実験の合図に対してより反応によりin vivoで様になる傾向があります。例えば、ラット初代肝細胞は、より多くの立方形形態、増加した生存性、チトクロームP450酵素活性のより大きな誘導を示すと2D文化17で増殖した細胞と比較して、市販のポリスチレン足場で増殖させた場合、パラセタモール毒性に対する感受性を増加させました。肝細胞癌細胞株HepG2はまた、アルブミンの生産18を増加させ、2D培養細胞19と比較して、メトトレキサートに応じ様in vivoでより多くを表示することが示されている同じ足場を使用します。初代ヒト肝細胞は、より高いチトクロームP450活性を遅延した脱分化を実証し、灌流培養システム20において試験した4/5の化合物のためのクリアランスを増加させました。市販のポリスチレン足場で培養したニューロンおよびグリア由来のヒト神経幹細胞は、高い(活動電位)と低freque両方を呈しNCY(ローカルフィールド電位)なしニューロンの活動に対し、自発的な活動は、2D培養細胞21で検出されました。 Caco-2細胞が増加し、アルカリホスファターゼ、γグルタミルトランスフェラーゼ及びP糖タンパク質の活性およびF-アクチンと透明帯のより高い発現occludens-1タンパク質16によって測定された2D文化に比べHFBで強化された分化を示しました。利点にもかかわらず、3D細胞培養を引用刊行数は過去10年間で(8倍の増加を成長しているが、2D組織培養フラスコの表面以外のシステムにおける細胞のルーチン培養はまだ、多くの研究室で実施されていない。ソース:「3D文化」)でプローブしたツールPubMedの「年度別結果」。
この原稿は、哺乳動物細胞培養用のHFBシステムの設定および動作条件を説明し、肝細胞癌細胞株HepG2 / C3Aを培養することで、その有用性を示します。この方法の目的は、培養物に細胞であります十分なシンプルさを保持し、よりin vivoでの様培養システムは、3D培養系に慣れていない人にはそれが受け入れられるようにします。アプリケーションにHFBsを使用して論理的根拠の肝臓モデルの予測可能性を改善することである、ここで記述は、HFB環境22内の肝臓シヌソイドを模倣することは理論的に可能であることです。これは、現在、他の培養系では不可能です。
この原稿は、哺乳動物細胞培養用の中空糸バイオリアクター(HFB)システムのセットアップと操作を説明し、その有用性は、肝細胞株HepG2 / C3A増殖で実証されています。システムは、標準のインキュベータの棚の上にフィットするように設計されており、そのセットアップは、無菌技術に精通している任意の有能な細胞生物学者によって行われるのに十分シンプルです。
ここで説明する研究システムで使用される繊維は、非生分解性独自のポリマーを使用して(回転)を鋳造位相反転スピンにより家で製造されます。例えば、細胞培養に適した、両方の生分解性および非生分解性材料の様々な紡糸によって繊維を作ることが可能です。ポリカプロラクトン(PCL)27、ポリ-L-ラクチド酸(PLLA)28、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)29、ポリスルホン(PSU)12およびポリエーテルエーテルケトン(PEEK)13。それぞれが異なる特性がありNDシステムのニーズに基づいて選択されるべきです。滅菌工程で使用されるエタノールを用い繊維の互換性を確認してください。 PLGAは、抗生物質/抗真菌剤溶液中25などの代替治療を必要とエタノールで可塑化することが知られています。
ここで使用されるガラスモジュールの寸法は、現在の研究の必要性に基づいて選択しました。異なるサイズは、任意の評判の良いガラス発泡会社によって製造することができます。モジュールサイズの考慮は、モジュール内の繊維、おそらく流量の数にリンクされているセルの数です。多くの細胞は、より高い流量がバイオリアクターの流出端に好ましい培養条件を維持するためにあることが必要となるモジュールです。これは、いくつかの点と限界に到達すると、いくつかの試行錯誤は、モジュール透過メディア状態を監視して必要とされ得ます。数学的モデリングは、必要なモジュールDIMENにいくつかの洞察を提供することができますsions及び流量22。
ここで使用される装置の寸法は、インキュベータの棚の上にフィットするように設計されています。チューブの長さも、セットアップと操作を可能にするためにコンポーネントの十分な移動を可能にしながら、コネクタ間に達するのに必要な長さによって決定されます。経時サンプリングモジュールの透過液中の培地条件のモニタリング、例えば、必要とされる場合、注入ポートを保持液に添加し、これを容易にするために線を透過することができます。
任意の細胞培養系のための前提条件は、生きている細胞を維持することであり、ほとんどの場合、成長します。三次元培養系で増殖させた細胞において表現型様インビボでよりを実証研究に照らして、また、密接に細胞が遭遇するインビボ環境を模倣する環境を提供するために重要と思われます。この最後の点は、多くの場合、この培養システムが提供する利便性を優先して2次元細胞培養では無視されます。 T彼は、繊維の内腔を通って細胞に栄養を供給することにより、in vivo毛細血管網における模倣をHFB。廃棄物は、また、動的流れによってシステムから除去されます。これは、細胞培養と密接にこれらの細胞を培養するための2D組織培養プラスチックに比べて、このシステムより良い選択をする、肝細胞で見られる生体内環境を模倣するもののためのインビボ様のシステムを作成します。これは、細胞が、2D組織培養プラスチック上で増殖させたものに比べHFB培養系において、アルブミンの15倍量の、重要な肝機能を分泌するという事実によって裏付けられます。
HFBシステムは、ほとんどのに適していない場合は、すべての足場依存性細胞型であるが、機能を培養することができるようにするため、実際の必要性があるため、ここでの例では、肝細胞のための製薬業界による薬剤開発で使用するための、よりin vivoの様肝細胞であります体外サポートのためのバイオ人工肝臓デバイスで肝不全患者の。複数の機能セルの必要性は、再生医療の分野は、翻訳作業の段階に入り、特にように、これらの実施例を越えて延びています。より多くのインビボ様培養環境の利点を見落としてはなりません。
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |