Funktionelle respons af celler i kultur kan forbedres ved dyrkning i mere in vivo-lignende 3-dimensionelle kultur miljøer 16-21. Dette håndskrift beskriver opsætning og drift af en hul fiber bioreaktor-system til in vivo-lignende pattedyr vævskultur.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
Vævskultur er en etableret teknik til vækst og / eller opretholdelse af celler, der er blevet anvendt i over 100 år 1,2. Bekvemmeligheden ved studerer celler og reaktioner ex vivo har vidtrækkende fordele tillader eksperimenter, der ellers ville være yderst udfordrende, hvis ikke umuligt, for eksempel dannelsen af genetisk konstruerede cellelinier, og anvendelsen af reporter-celler i højt gennemløb screeningsassays 3. For nylig vævskultur har givet anledning til området for tissue engineering, til frembringelse af in vitro-modeller og til regenerativ medicin. Med disse programmer, har interesse i dynamiske 3-dimensional (3D) dyrkningssystemer vokset betydeligt.
3D dyrkningsmetoder (defineret her som en 3D-kultur substrat og / eller indførelse af retningsbestemt dynamisk flow) bedre rekapitulere arkitektur in vivo cellulære miljø, vigtigt for at opnå enmere fysiologisk-lignende funktion. Evnen til at udtrække, vokse, differentiere og transplantation celler med det formål at reparere sygt og beskadiget væv er et fagområde, der har et stort potentiale for patient gavn og kommercielle muligheder. For eksempel brugen af autologe keratinocytter til behandling forbrændinger (se 4) og anvendelse af cellebaserede behandlingsformer til behandlingen af slagtilfælde (se 5). Ligeledes markedet for in vitro-modeller spænder lægemiddelforskning til stratificeret medicin applikationer. Konventionen i vævskultur er væksten af adhærente eller forankringsafhængige celletyper på 2-dimensional (2D) overflade af en vævsdyrkningskolbe. Mens øjeblikket accepteret som den gyldne standard i et forskningsmiljø, har nylige interesse i væv ingeniørmæssige anvendelser understregede, at nuværende 2D vævskultur miljø er utilstrækkelig til den nødvendige opskalering i celle produktion 6.
For vedhængende celletyper en scaffold er påkrævet, som vil variere afhængigt af slutanvendelsen, både med hensyn til den kemiske sammensætning og de mekaniske egenskaber. Nogle systemer anvender stilladser samt-plade indsatser, der består af meget porøs matrix dannet af stor indre fase emulsion templating (se 7) eller elektrospundne fibre (se 8) kræver minimum tilpasning fra konventionelle 2D kultur teknikker. Celler kan podes på mikrobærere af varierende kompositioner og dyrkes i omrørte tanke, der leverer næringsstoffer og signalmolekyler, og bære væk affaldsprodukter (masse transport) gennem en dynamisk godt blandet miljø 9. Men disse systemer begrænset i deres in vivo-lignende miljø, og kan foretages yderligere forbedringer med hensyn til at skalere op omkostninger. Hul fiber bioreaktorer (HFBs) er et 3D kultur, der består af fibre, der er fastsat i et modul med celler typisk podet på ydersiden af de porøse fibre og medier, der leveres gennem fiberen lumen (gennemgået i 10) (figur 1). HFBs tilbyde en in vivo-lignende miljø med fibrene efterligner blodkapillærer og afskærmning af cellerne fra de forskydningsspændinger, der er forbundet med dynamisk medier levering, samtidig med at defineret forskydning, der skal anvendes til celler de via fluidstrømning gennem sideporte hvis det ønskes. Dette skaber en alsidig dyrkningssystem med overlegen stoftransport i hvor høj celledensiteter kan nås 11. Den HFB system er velegnet til opretholdelse af forankringsafhængige celletyper og er blevet anvendt til at dyrke en række celler, herunder rotte pancreas-øer af Langerhans 12, muse β-TC-3 insulinoma cellelinie 12, primære humane hepatocytter 13, human knogle marv mononukleære celler 14, Madin Darby nyreceller fra hund (MDCK) 15 og Caco-2 celler 16 at nævne nogle få.
Ud over systemet fordele ved massetransport og opskalering, celler dyrket i 3D tissagsøge kultur systemer tendens til at være mere in vivo-lignende i morfologi og mere lydhøre over for eksperimentelle signaler. For eksempel rotte primære hepatocytter viser en mere terningformet morfologi, øget levedygtighed, større induktion af cytochrom-P450-enzymaktivitet og forøget følsomhed over for paracetamol toksicitet ved dyrkning i et kommercielt tilgængeligt polystyren stillads sammenlignet med celler dyrket i 2D kultur 17. Under anvendelse af samme stillads den leverkarcinom HepG2 har også vist sig at øge albumin produktionen 18 og viser en mere in vivo-lignende respons på methotrexat sammenlignet med 2D dyrkede celler 19. Primære humane hepatocytter viste forsinket dedifferentiering, højere cytochrom-P450-aktivitet og øget clearance til 4/5 testede forbindelser i et perfusion kultur 20. Humane neurale stamceller afledte neuroner og glia dyrket i en kommercielt tilgængelig polystyren stillads udstillet både høj (aktionspotentiale) og lav-frequeNCY (lokal felt potentielle) spontan aktivitet mens ingen neuronal aktivitet blev påvist i 2D dyrkede celler 21. Caco-2-celler vist bedre differentiering i en HFB forhold til 2D kultur målt ved forhøjet alkalisk phosphatase, γ-glutamyltransferase og P-glycoprotein aktivitet og højere ekspression af F-actin og zona occludens-1 protein 16. Til trods for fordelene, rutinen dyrkning af celler i andre end en 2D vævskulturkolbe overflade systemer stadig ikke praktiseres i mange laboratorier, selv om antallet af publikationer, der citerer 3D cellekultur vokser (8 gange stigning i de sidste 10 år. Kilde : PubMed 'resultater efter Year' værktøj sonderet med '3D kultur «).
Dette håndskrift beskriver opsætning og driftsbetingelser af et HFB system til pattedyr celle kultur og viser sin nytte i at dyrke hepatocarcinoma HepG2 / C3A. Formålet med denne metode er at dyrke cellerne ien mere in vivo-lignende kultur, der bevarer nok enkelthed til at gøre det modtagelig for dem, der er nye til 3D dyrkningssystemer. Rationalet bag ved hjælp HFBs i ansøgningen beskrive her, som er at forbedre forudsigeligheden af leveren modeller er, at det er teoretisk muligt at efterligne en hepatisk sinusoid i HFB miljø 22. Dette er ikke i øjeblikket er muligt med andre dyrkningssystemer.
Dette håndskrift beskriver opsætning og drift af en hul fiber bioreaktor (HFB) system til pattedyr celle kultur og dens anvendelighed demonstreres i prolifererende hepatocytsuspensionen HepG2 / C3A. Systemet er designet til at passe ind på hylden for en standard inkubator og dens opbygning er enkel nok til at udføres af en kompetent celle biolog fortrolig med aseptisk teknik.
De anvendes i forskningssystemet her beskrevne fibre fremstilles i huset ved faseinversion spin-støbning (spinning) ved hjælp af en ikke-biologisk nedbrydelig proprietære polymer. Det er muligt at lave fibre ved spinding fra en række materialer, der er egnede til celledyrkning, både bionedbrydelige og ikke-bionedbrydelige, f.eks; polycaprolacton (PCL) 27, poly-L-lactid acid (PLLA) 28, poly (mælke-co-glycolsyre) (PLGA) 29, polysulfon (PSU) 12 og polyetheretherketon (PEEK) 13. Hver har forskellige egenskaber ennd bør vælges baseret på de behov af systemet. Tjek kompatibiliteten af de beskæftigede fiber med ethanol anvendes i sterilisering trin. PLGA er kendt for at blødgøre med ethanol nødvendiggør en alternativ behandling såsom antibiotika / antimykotisk løsning 25.
Dimensionerne af glasset moduler, der bruges her blev valgt baseret på behovene for den aktuelle forskning. Forskellige størrelser kan foretages af enhver velansete glasblæsning selskab. En overvejelse i modul størrelse er antallet af celler, som er forbundet med antallet af fibre i modulet og sandsynlige strømningshastigheder. Jo flere celler, der er i modulet den højere strømningshastighederne skal være for at fastholde gunstige dyrkningsbetingelser ved udstrømningsenden af bioreaktoren. Dette vil nå en grænse et tidspunkt, og nogle trial and error kan være påkrævet med overvågning af medieforhold i modulet permeat. Matematisk modellering kan give nogle indsigt i de nødvendige modul dimemelser og flowhastigheder 22.
Dimensionerne af apparatet bruges her er udformet til at passe på en inkubator hylde. Længden af slangen er dikteret af længden er nødvendig for at nå op på mellem stikkene samtidig tillader nok bevægelse af komponenter for at give mulighed for opsætning og drift. Hvis tidsforløbet prøveudtagning er påkrævet, for eksempel ved overvågning af medieforhold i modulet permeat derefter injektionsporte kan tilsættes til retentatet og permeat linjer for at lette dette.
En forudsætning for et cellekultursystem er at holde cellerne i live og i de fleste tilfælde vokser. I lyset af undersøgelser, der viser en mere in vivo-lignende fænotype i celler dyrket i 3D dyrkningssystemer synes det også vigtigt at skabe et miljø, der nøje efterligner in vivo miljø støder cellerne. Dette sidste punkt er ofte overset i 2D cellekultur til fordel for bekvemmelighed denne kultur system tilbyder. Than HFB efterligner in vivo kapillære netværk ved at levere næringsstoffer til cellerne gennem lumenet af fibre. Spildprodukterne også fjernes fra systemet med den dynamiske flow. Dette skaber en in vivo-lignende system til celledyrkning og en, der nøje efterligner in vivo-miljø set af hepatocytter, hvilket gør dette system et bedre valg i forhold til 2D vævskulturplast til dyrkning af disse celler. Dette bekræftes af det faktum, at cellerne udskiller 15 gange mængden af albumin, en vigtig leverfunktion, i HFB kultur-systemet i forhold til dem, der dyrkes på 2D vævskultur plast.
Mens HFB systemet er velegnet til de fleste, hvis ikke alle forankringsafhængige celletyper, eksemplet her er for hepatocytter, fordi der er et reelt behov for at kunne kultur funktionel, mere in vivo-lignende hepatocytter til brug i lægemiddeludvikling fra medicinalindustrien og i biosyntetiske lever indretninger til ekstrakorporal støtteaf leversvigt patienter. Behovet for flere funktionelle celler strækker sig ud over disse eksempler, især da området regenerativ medicin går ind i en fase af translationel arbejde. Fordelene ved en mere in vivo-lignende kultur miljø ikke bør overses.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |