HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
엑소 좀은 세포 유형의 다양한 구성 적 자극 모두에 릴리스이 30 nm 내지 100nm 범위의 크기에 작은 소포이다. 이들은 생물학적 유체의 번호에서 발견되는 단백질, 지질, 핵산 분자의 다양성을 수행하는 것으로 알려져있다. 원래 세포 파편을위한 저수지보다 더 작은, 생물학적 과정을 조절하는 엑소 좀과 질병의 역할이 점점 더 감사합니다 것으로 생각했다.
방법은 여러 세포 배양 배지, 생물학적 유체에서 엑소 좀을 분리를 위해 설명되었다. 그들의 작은 크기 및 저밀도, 초 원심 미분 및 / 또는 한외 엑소 격리를위한 가장 널리 사용되는 기술들이다. 그러나, HIV-1에 감염된 개인의 플라즈마는 크기와 밀도 비슷 두 엑소 좀과 HIV 바이러스 입자가 포함되어 있습니다. 따라서, 인간 혈장에서 HIV 바이러스 입자에서 엑소 좀을 효율적으로 분리하고있다도전.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 Cantin 등으로부터 변성 과정을 개발 하였다. 알., 인간 혈장에서 HIV 입자에서 엑소 좀 정화용 2008. Iodixanol 속도 구배는 HIV-1 양성 개인의 혈장에서 HIV-1 입자에서 엑소 좀을 분리 하였다. 바이러스 입자는 P24 ELISA에 의해 확인되었다. 엑소 좀은 엑소 마커 아세틸 콜린 에스 테라 제의 기초 (아세틸 콜린), 및 CD9, CD63 및 CD45 항원을 동정 하였다. 우리 구배 절차는 바이러스 입자의 자유로운 엑소 제제를 수득 하였다. 인간 혈장에서 엑소 좀의 효율적인 정제 혈장 유래 엑소 좀의 내용을 검사하고, 면역 조절 성 전위 및 기타 생물학적 기능을 조사 할 수있었습니다.
Introduction
HIV-1 전염병은 세계에 걸쳐 상당한 영향을 계속. 2013 년으로, 전 세계적으로 약 35 만 명이 HIV에 살고,이 중 210 만 새로 감염된 사람 1이었다. 예방 전략과 항 레트로 바이러스 치료에 증가 접근은 HIV의 전체 인수를 줄이는데 도움이되고있다. 그러나, 개인의 인구는 여전히 HIV 1의 인수에 상승을 경험하고있다. 따라서,이 전염병을 해결하기 위해 계속 노력이 필요하다.
에이즈 질병 진행의 가장 강력한 예측 인자 중 하나는 만성 면역 활성화 (CIA) 2-10이다. 검출 사이토 카인 및 T 림프구의 표면에 높은 표현 마커의 지속적으로 높은 수준의 정의, 중앙 정보국 (CIA)은에 기인하고있다 : 나는 11 IFN 유형 I) 연속 수지상 세포 생산; HIV 단백질 문신, 네프와 gp120의 (12)에 의해 구동 (II) 직접 면역 활성화; (III장 관련 면역 세포 6 박테리아 단백질) 전좌. 그러나, 정확한 메커니즘은 만성 하부는 HIV 감염에 전신성 면역 활성화는 완전히 밝혀지지 남아있다.
우리의 연구 그룹과 다른 사람은 에이즈 발병 15 ~ 18의 엑소 좀의 역할을 증명하고있다. 우리 그룹 네프 단백질 엑소 좀 15에 감염된 세포로부터 분비되는 것으로 판정하였으며, exosomal 네프 (exNef)은 나노 그램 수준 18 HIV 감염자의 혈장에 존재한다. 우리는 또한, 단핵구 / 대 식세포가 exNef에 의한 세포 사멸에 반응했다. exNef에 노출 된 CD4 + T 세포가 CXCR4 통로 (19), (20)에 따라 활성화 유도 된 세포의 죽음을 초래하는 방관자를 표시하지만, 변형 된 세포 기능 및 사이토 카인의 발현을 전시했다. HIV에 감염된 사람의 혈장에서 분리 된 가장 최근에, 우리 그룹이 보여 주었다 엑소 좀은 염증성 사이토 카인의 다양한 포함되어 있습니다. 부rther, 메모리 및 중앙 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포상에서 CD38의 발현을 유도하는 HIV 감염 환자에서 혈장 유래 엑소 좀에 노출 나이브 말초 혈액 단핵 세포. 이 가능성이 전신 염증과 방관자 세포 활성화 (21)를 통해 바이러스 전파에 기여하고, 엑소 좀은 에이즈 발병 기전에 중요한 역할을한다는 것을 의미한다.
HIV의 병인에서 엑소 좀의 역할을 조사하고, 하나의 도전은 HIV 입자로부터 효율적으로 분리 된 엑소 좀 exosomal 콘텐츠를 유지하면서,뿐만 아니라 면역 조절 성 기능적 능력에 기술들을 개발하고있다. 몇몇 방법은 세포 배양 물 및 생물학적 유체 (22, 23)에서 엑소 좀을 분리를 위해 설명되었다. 그들의 작은 크기 및 낮은 밀도 (엑소 좀은 1.15의 밀도 부동 – 1.19 g / ㎖), 차동 초 원심 분리 및 / 또는 한외 여과가 엑소 아이솔레이션 (23)이 가장 일반적으로 사용되는 기술이다.그러나 HIV에 감염된 세포 배양 상층 액과 환자의 혈장은 엑소 좀과 HIV-1 바이러스 입자를 모두 포함되어 있습니다. 엑소 좀과 HIV-1 입자 크기와 밀도 모두에서 매우 유사합니다. 대안 적으로, CD63, CD45 및 CD81와 같은 고유 exosomal 마커의 발현을 활용 엑소 좀은 면역 캡처 방법 (23)을 사용하여 분리되었다. 이 절차는 엑소 좀에서 바이러스를 분리 할 수 있습니다. 그러나,이 기술의 단점은 배양에서 엑소 좀의 면역 가능성을 방해 할 수있는 평가 엑소 좀 정제, 항체의 단단한 부착이다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 Iodixanol 속도 구배를 사용하여 HIV의 Cantin에서 변성 인간 혈장 내의 입자 및 동료 엑소 좀 (22)로부터의 정제 방법을 개발 하였다. 바이러스 입자는 높은 반면에 편석 엑소 좀은 저밀도에서 iodixanol 구배 / 상부 분획을 분리하는 것으로 나타났다밀도 / 낮은 분수. 바이러스 입자는 P24 ELISA에 의해 식별하고, 엑소 좀은 아세틸 콜린 엑소 마커, CD9, CD63 및 CD45를 사용하여 확인 하였다. 수집 상단 저밀도 분수는 HIV-1의 P24 오염에 대한 음성이었다 엑소 좀을 포함. 인간 혈장에서 HIV 입자로부터 엑소 좀의 효율적인 정제 및 분리는 인간 혈장뿐만 아니라 면역 조절 성 전위의 조사 및 HIV-1 발병 엑소 좀의 진단 및 예후 유래의 엑소 좀의 컨텐츠에 대한 정확한 검사를 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
만성 면역 활성화 (CIA) 및 CD4 + T 세포 고갈은 HIV-1 감염의 두 가지 중요한 특징이다. 그들은 중앙 정보국 (CIA)이 가장 좋은 예측 인자 인 상태, 발병 기전에 대한 예측 인자로 설립되었다. 그러나, 만성 전신성 면역 활성화와 CD4 + T 세포의 감소를 구동 기전은 아직 완전히 규명되지 않았다. 우리와 다른 연구소는 HIV-1에 감염된 세포에서 분비되는 엑소 좀은 모두 특징에 중요한 역할을한다는 확고한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
