Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Os exossomas são pequenas vesículas que variam em tamanho de 30 nm a 100 nm, que são libertadas tanto constitutivamente e por estimulação de uma variedade de tipos de células. Eles são encontrados em vários fluidos biológicos, e são conhecidos para transportar uma variedade de proteínas, lípidos, e moléculas de ácido nucleico. Originalmente pensou-se pouco mais do que os reservatórios de detritos celulares, os papéis de exossomas regulam processos biológicos e em doenças são cada vez mais apreciados.
Vários métodos foram descritos para o isolamento de exossomas a partir de meios de cultura celular e fluidos biológicos. Devido ao seu pequeno tamanho e baixa densidade, ultracentrifugação diferencial e / ou de ultraf iltração são as técnicas mais vulgarmente utilizadas para isolamento de exossoma. No entanto, plasma de HIV-1 contém ambos os indivíduos infectados exossomas e partículas virais de HIV, que são semelhantes em tamanho e densidade. Assim, a separação eficiente de exossomas a partir de partículas virais de HIV no plasma humano tem sidoum desafio.
Para resolver esta limitação, foi desenvolvido um procedimento modificado a partir do Cantin et. ai., 2008, para a purificação de exossomas a partir de partículas de HIV em plasma humano. Iodixanol gradientes de velocidade foram usadas para separar os exossomas a partir de partículas de HIV-1 no plasma de HIV-1 em indivíduos positivos. Partículas de vírus foram identificados por ELISA p24. Os exossomas foram identificados com base nos marcadores de exossoma acetilcolinesterase (AChE), e os antigénios CD9, CD63, CD45 e. Nosso procedimento gradiente renderam preparações exossoma livres de partículas de vírus. A purificação eficiente de exossomas a partir de plasma humano nos permitiu examinar o conteúdo de exossomas derivados do plasma e para investigar o seu potencial imunomodulador e outras funções biológicas.
Introduction
O HIV-1 epidemia continua a ter um impacto significativo em todo o mundo. A partir de 2013, aproximadamente 35 milhões de pessoas no mundo viviam com HIV e 2,1 milhões delas eram indivíduos recém-infectadas 1. As estratégias de prevenção e maior acesso à terapia anti-retroviral tem sido útil para reduzir a aquisição global de HIV. No entanto, as populações individuais ainda estão experimentando aumentos na aquisição de HIV 1. Assim, há uma necessidade de prosseguir os esforços para enfrentar esta epidemia.
Um dos mais fortes preditores de progressão da doença HIV é ativação imune crônica (CIA) 2-10. Definido por níveis persistentemente elevados de citocinas e marcadores detectáveis de expressão elevados sobre a superfície dos linfócitos T, a CIA tem sido atribuída a: i) a produção contínua de células dendríticas de IFN tipo I 11; (ii) a ativação imune direto impulsionado por proteínas do HIV Tat, Nef e gp120 12; (iii) Translocação de proteínas bacterianas no intestino associada células imunes 6. No entanto, o mecanismo exato (s) crónica subjacente, ativação imune sistêmica na infecção pelo HIV continuam a ser totalmente elucidado.
Nosso grupo de pesquisa e outros têm demonstrado um papel de exossomos na patogênese do HIV 15-18. Nosso grupo determinou que a proteína Nef é excretada a partir de células infectadas em exossomos 15, e exosomal Nef (exNef) está presente no plasma de indivíduos infectados pelo HIV em níveis de nanogramas 18. Mostrámos que espectador células T CD4 + expostas a exNef resultou em induzida por activação das células da morte dependente da via CXCR4 19, 20. Alternativamente, monócitos / macrófagos eram refractários à apoptose induzida por exNef, mas exibiu as funções celulares alteradas e expressão de citoquinas. Exossomas Mais recentemente, o nosso grupo demonstrou isoladas a partir do plasma de indivíduos infectados com HIV contêm uma variedade de citoquinas pró-inflamatórias. Further, células mononucleares de sangue periférico naive expostos a exossomas derivados de plasma de doentes infectados com VIH induzidas expressão de CD38 em células de memória central e ingénuos CD4 + e CD8 +. Isso provavelmente contribui para a inflamação sistémica e propagação virai através da activação de células espectador 21, e sugere que exossomas desempenhar um papel significativo na patogénese do VIH.
Ao investigar o papel de exossomos na patogênese do HIV, um desafio é o desenvolvimento de técnicas para exossomos eficientemente separados de partículas de HIV, mantendo o conteúdo exosomal, bem como a sua capacidade imunomoduladora funcional. Vários métodos foram descritos para o isolamento de exossomas a partir de cultura de células e fluidos biológicos 22,23. Devido ao seu pequeno tamanho e baixa densidade (exossomas flutuar a uma densidade de 1,15 – 1,19 g / ml), ultracentrifugação e / ou ultrafiltração diferencial são as técnicas mais vulgarmente utilizadas para isolamento 23 exossoma.No entanto, os sobrenadantes de cultura de células infectadas pelo HIV e no plasma dos pacientes conter ambos os exossomas e HIV-1 As partículas virais. Os exossomas e partículas de HIV-1 são muito semelhantes em tamanho e densidade. Alternativamente, tomando vantagem da expressão de marcadores exosomal únicas, tais como CD63, CD45, CD81 e, os exossomas foram isolados utilizando métodos de captura 23 de imunoafinidade. Este procedimento pode separar vírus de exossomos. No entanto, a desvantagem desta técnica é a ligação apertada de anticorpos para os exossomas purificadas, o que poderia interferir com a avaliação do potencial imunomodulador dos exossomas em cultura.
Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos um processo para a purificação de exossomos de partículas de HIV no plasma humano modificados a partir Cantin e colegas de trabalho, utilizando 22 IODIXANOL gradientes de velocidade. Exossomos foram encontrados para segregar na baixa densidade / frações superiores da gradientes iodixanol, enquanto que partículas virais segregadas no altoDensidade / fracções inferiores. Partículas do vírus foram identificados por ELISA p24 e exossomos foram identificados utilizando marcadores do exossomo Ache, CD9, CD63 e CD45. As frações de baixa densidade superior recolhidos contida exossomos, que eram negativas para a contaminação pelo HIV-1 p24. A purificação eficiente e separação de exossomas a partir de partículas de HIV em plasma humano permite a análise precisa do conteúdo de exossomas provenientes de plasma humano, bem como a investigação do seu potencial imunomodulador e o valor diagnóstico e prognóstico de exossomas no VIH-1 patogénese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Activação imunitária crónica (CIA) e a depleção de células T CD4 + são duas características importantes da infecção por HIV-1. Eles foram estabelecidos como preditores para patogênese, com CIA ser o melhor preditor. No entanto, os mecanismos subjacentes que impulsionam ativação imune crônica sistêmica e declínio de células CD4 + T ainda não foram completamente elucidados. Nós e outros laboratórios têm desenvolvido evidência sólida de que exossomas segregadas a partir de HIV-1 de células infectad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
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