Summary

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Published: January 05, 2016
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Summary

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Abstract

Los exosomas son pequeñas vesículas que van en tamaño desde 30 nm a 100 nm que se liberan tanto de manera constitutiva y a la estimulación de una variedad de tipos de células. Se encuentran en un número de fluidos biológicos y son conocidos por llevar una variedad de proteínas, lípidos y moléculas de ácido nucleico. Originalmente pensado para ser poco más que depósitos para desechos celulares, los roles de los exosomas que regulan los procesos biológicos y en enfermedades son cada vez más apreciados.

Varios métodos han sido descritos para el aislamiento de exosomas de medios de cultivo celular y los fluidos biológicos. Debido a su pequeño tamaño y baja densidad, ultracentrifugación diferencial y / o ultrafiltración son las técnicas más comúnmente utilizadas para el aislamiento exosome. Sin embargo, el plasma del VIH-1 en individuos infectados contiene tanto exosomas y las partículas virales del VIH, que son similares en tamaño y densidad. Por lo tanto, la separación eficiente de los exosomas de partículas virales de VIH en plasma humano ha sidoun desafío.

Para hacer frente a esta limitación, hemos desarrollado un procedimiento modificado de Cantin et. al., 2008 para la purificación de exosomas de partículas de VIH en el plasma humano. Iodixanol gradientes de velocidad se utilizaron para separar los exosomas del VIH-1 partículas en el plasma de VIH-1 en individuos positivos. Las partículas de virus fueron identificados por ELISA p24. Los exosomas se identificaron sobre la base de marcadores de exosoma de la acetilcolinesterasa (AChE), y los antígenos CD9, CD63, CD45 y. Nuestro procedimiento de gradiente produjo preparaciones exosome libres de partículas de virus. La purificación eficiente de los exosomas del plasma humano nos permitió examinar el contenido de los exosomas derivados de plasma y para investigar su potencial modulador inmune y otras funciones biológicas.

Introduction

El VIH-1 epidemia sigue teniendo un impacto significativo en todo el mundo. A partir de 2013, aproximadamente 35 millones de personas en el mundo vivían con el VIH, y 2,1 millones de ellos eran personas recién infectadas 1. Las estrategias de prevención y un mayor acceso a la terapia antirretroviral han sido de gran ayuda en la reducción de la adquisición global de VIH. Sin embargo, las poblaciones individuales siguen experimentando alzas en la adquisición del VIH 1. Por lo tanto, existe la necesidad de seguir trabajando para hacer frente a esta epidemia.

Uno de los más fuertes predictores de la progresión de la enfermedad del VIH es la activación inmune crónica (CIA) 2-10. Definido por niveles persistentemente elevados de citocinas y marcadores detectables elevada expresión en la superficie de los linfocitos T, la CIA se ha atribuido a: i) la producción de células dendríticas continua de IFN de tipo I 11; (ii) la activación inmune directa impulsado por las proteínas del VIH Tat, Nef y gp120 12; (iii) Translocación de proteínas bacterianas en el intestino asociado células inmunes 6. Sin embargo, el mecanismo exacto (s) crónica subyacente, la activación inmune sistémica en la infección por el VIH aún no se han esclarecido completamente.

Nuestro grupo de investigación y otros han demostrado un papel de exosomas en la patogénesis del VIH de 15-18. Nuestro grupo ha determinado que la proteína Nef se excreta de las células infectadas en exosomas 15 y exosomal Nef (exNef) está presente en el plasma de individuos infectados por el VIH a niveles de nanogramos 18. Hemos demostrado que transeúnte células T CD4 + expuestos a exNef dieron lugar a la activación inducida por la muerte celular dependiente de la vía de CXCR4 19, 20. Alternativamente, los monocitos / macrófagos fueron refractarios a la apoptosis inducida por exNef, pero exhibido funciones celulares alteradas y la expresión de citoquinas. Exosomas Recientemente, nuestro grupo ha demostrado aisladas del plasma de personas infectadas con el VIH contienen una variedad de citoquinas pro-inflamatorias. Further, las células mononucleares de sangre periférica tratados previamente expuestos a exosomas derivados del plasma de pacientes infectados por el VIH inducidas expresión de CD38 en las células de memoria naïve y el centro de T CD4 + y CD8 +. Esto probablemente contribuye a la inflamación sistémica y la propagación viral través de la activación celular espectadora 21, y sugiere que los exosomas juegan un papel importante en la patogénesis del VIH.

Al investigar el papel de los exosomas en la patogénesis del VIH, un desafío está desarrollando técnicas para exosomas eficazmente separados de partículas de VIH manteniendo al mismo tiempo el contenido exosomal así como su capacidad inmunomoduladora funcional. Varios métodos han sido descritos para el aislamiento de exosomas del cultivo de células y fluidos biológicos 22,23. Debido a su pequeño tamaño y baja densidad (exosomas flotan a una densidad de 1,15 – 1,19 g / ml), ultracentrifugación diferencial y / o ultrafiltración son las técnicas más comúnmente utilizadas para el aislamiento exosome 23.Sin embargo, con infección por VIH sobrenadantes de cultivo celular y el plasma de los pacientes contienen tanto exosomas y el VIH-1 partículas virales. Los exosomas y el VIH-1 partículas son muy similares en tamaño y densidad. Alternativamente, aprovechando la expresión de marcadores exosomal únicas, tales como CD63, CD45, CD81 y, exosomas han sido aislados utilizando métodos de captura de inmunoafinidad 23. Este procedimiento puede separar virus de exosomas. Sin embargo, el inconveniente de esta técnica es la unión apretada de anticuerpos frente a los exosomas purificados, lo que podría interferir con la evaluación del potencial inmunomodulador de los exosomas en cultivo.

Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un procedimiento para la purificación de exosomas de partículas de VIH en el plasma humano modificados de Cantin y compañeros de trabajo 22 utilizando gradientes de velocidad Iodixanol. Fueron encontrados exosomas para segregar en el de baja densidad / fracciones superiores del gradiente iodixanol, mientras que las partículas de virus segregados en el altofracciones de densidad / inferiores. Las partículas de virus fueron identificados por ELISA p24 y exosomas se identificaron utilizando marcadores exosome AChE, CD9, CD63, CD45 y. Las fracciones de baja densidad superiores recogidos contenían exosomas que fueron negativas para la contaminación del VIH-1 p24. La purificación eficiente y la separación de exosomas de partículas de VIH en plasma humano permite examen preciso del contenido de exosomas derivados de plasma humano, así como la investigación de su potencial inmunomodulador y el valor diagnóstico y pronóstico de exosomas en el VIH-1 patogénesis.

Protocol

Un esquema general del procedimiento de aislamiento exosoma y purificación se proporciona en la Figura 1. Toda la sangre se obtiene de donantes voluntarios sanos y de personas con VIH que no reciben theraoy antirretroviral asistir a la Clínica de la Esperanza, de la Universidad de Emory y el Programa de Enfermedades Infecciosas del Sistema de Salud Grady en Atlanta, Georgia. Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad de Emory y la Escuela de …

Representative Results

Los exosomas son purificados eficazmente a partir de VIH-1 en plasma humano positivo. Exosomas aislados, identificados por actividad de la acetilcolinesterasa (AChE), separados en fracciones de menor densidad 1-3 en la parte superior de los gradientes de iodixanol, mientras que las partículas de virus, identificados por el VIH-1 antígeno p24 , segregados en las fracciones de mayor densidad (10-12, cerca de la parte inferior). La presencia de exosomas se confirmó adici…

Discussion

La activación crónica inmune (CIA) y la depleción de células T CD4 + son dos características importantes de la infección VIH-1. Ellos se han establecido como predictores de la patogénesis, con la CIA de ser el mejor predictor. Sin embargo, los mecanismos subyacentes que impulsan la activación inmune sistémica crónica y el deterioro de las células T CD4 + todavía no han sido completamente aclarada. Nosotros y otros laboratorios han desarrollado pruebas firmes de que los exosomas secretadas por el VIH-1 en las…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

Materials

BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)  Becton Dickinson 368589 pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent Cosmo Bio AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent Sigma D1556
14ml ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344060 ultraclear tubes
Gradient Former Model 485 BIO-RAD 165-4120
Acetylthiocholine iodide Sigma 1480
Benzoic Acid Sigma D8130
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Acetyl Cholinesterase Sigma C3389
96-well clear microtiter plate Medical Supply Partners TR5003
SpectraMax 190 microplate reader Molecular Devices 190 Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell BIO-RAD 165-6001
Transblot Gel  BIO-RAD 170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels BIO-RAD 567-1093
Anti-CD45 antibody  Abcam  Ab10558
CD63 Antibody (H-193) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-15363
CD9 Antibody (H-110) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1  ImmunoDX, LLC 1303
Nitrocellulose membrane  BIO-RAD G1472430
Tris Buffered Saline BIO-RAD 170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31460 Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31430 Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotech, Inc. SC-2048
GE LAS-4010 Imager GE Healthcare LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit Affymetrix  N/A Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader BIO-RAD 171-000201
Coulter Z2 Particle Counter Beckman Coulter 383552 Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 BD Bioscience (UCHT1) 300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4 Biolegend (OKT4) 317418
PerCP-labeled anti-CD4 BD Bioscience (RPA-T8) 550631
V450-labeled anti-CD8 BD Bioscience (RPA-T8) 560347
Biotin-labeled anti-CD45RA BD Bioscience (HI100) 555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L Biolegend (DREG-56) 304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38 Biolegend (HIT2) 303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR Biolegend (L243) 307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin BD Bioscience 551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K Biolegend (MOPC-21) 400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK Biolegend (MOPC-173) 400229

References

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Cite This Article
Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).

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