Isolering av Exosomes fra Plasma av HIV-1 Positive Personer
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Exosomes er små vesikler som varierer i størrelse fra 30 nm til 100 nm som frigjøres både konstitutivt og ved stimulering av en rekke celletyper. De er funnet i en rekke biologiske fluider, og er kjent for å bære en rekke proteiner, lipider og nukleinsyremolekyler. Opprinnelig tenkt å være litt mer enn reservoarer for mobilnettet rusk, er rollene til exosomes regulerer biologiske prosesser og ved sykdommer stadig verdsatt.
Flere metoder er blitt beskrevet for å isolere exosomes fra celledyrkningsmedier og biologiske væsker. På grunn av sin lille størrelse og lav tetthet, differensial ultrasentrifugering og / eller ultrafiltrering er de mest brukte teknikker for exosome isolasjon. Imidlertid inneholder plasma av HIV-1-infiserte individer både exosomes og HIV-viruspartikler, som er lik i størrelse og tetthet. Det har således effektiv separasjon av exosomes fra HIV-viruspartikler i humant plasma har værten utfordring.
For å møte denne begrensningen, har vi utviklet en prosedyre forandret fra Cantin et. al., 2008 for rensing av exosomes fra HIV-partikler i humant plasma. Iodixanol hastighetsgradienter ble anvendt for å separere exosomes fra HIV-1 partikler i plasma hos HIV-1-positive individer. Viruspartikler, ble identifisert ved p24 ELISA. Exosomes ble identifisert på grunnlag av exosome markører acetylkolinesterase (AChE), og de CD9, CD63 og CD45 antigener. Vår gradient fremgangsmåten ga exosome forberedelser gratis viruspartikler. Den effektive rensing av exosomes fra humant plasma gjort oss i stand til å undersøke innholdet av plasmafremstilte exosomes og å undersøke deres immunmodulerende potensial og andre biologiske funksjoner.
Introduction
HIV-1-epidemien fortsetter å ha en betydelig innvirkning på hele verden. Som for 2013, ble omtrent 35 millioner mennesker verden over lever med hiv, og 2,1 millioner av disse var nysmittede personer 1. Forebyggende strategier og økt tilgang til antiretroviral behandling har vært nyttig for å redusere den samlede kjøpet av HIV. Imidlertid er enkelte bestander fortsatt opplever økning i kjøp av HIV 1. Dermed er det behov for fortsatt innsats for å løse denne epidemien.
En av de sterkeste prediktor for HIV sykdomsprogresjon er kronisk immunaktivering (CIA) 2-10. Definert ved vedvarende høyt nivå av påviselige cytokiner og forhøyet uttrykk markører på overflaten av T-lymfocytter, er CIA blitt tilskrevet: i) kontinuerlig dendrittiske celleproduksjon av type I IFN-11; (ii) direkte aktivering av immunsystemet drevet av HIV-proteiner Tat, Nef og gp120 12; (iii) Translokasjon av bakterielle proteiner i gut forbundet immunceller 6. Men den eksakte mekanismen (e) underliggende kronisk, systemisk aktivering av immunsystemet i HIV-smitte fortsatt ikke helt klarlagt.
Vår forskningsgruppe og andre har vist en rolle exosomes i HIV patogenesen 15-18. Vår gruppe har bestemt at Nef protein utskilles fra infiserte celler i exosomes 15, og exosomal Nef (exNef) er til stede i plasma hos HIV-smittede personer på nanogram nivåer 18. Vi har vist at bystander CD4 + T-celler utsatt for exNef resulterte i aktiverings-indusert celledød avhengig av CXCR4 veien 19, 20. Alternativt, monocytter / makrofager var refraktære til exNef-indusert apoptose, men viste endrede cellulære funksjoner og cytokin ekspresjon. I det siste har vår gruppe vist exosomes isolert fra plasma hos HIV-infiserte individer inneholder en rekke proinflammatoriske cytokiner. Further, naive perifert blod mononukleære celler eksponert for plasmafremstilte exosomes fra HIV-infiserte pasienter indusert uttrykk for CD38 på naiv og sentrale minne CD4 + og CD8 + T-celler. Dette bidrar sannsynligvis til systemisk inflammasjon og viral propagering via bystander celleaktivering 21, og antyder at exosomes spiller en vesentlig rolle i patogenesen av HIV.
I å undersøke hvilken rolle exosomes i HIV patogenesen, er én utfordring å utvikle teknikker for å effektivt separate exosomes fra HIV partikler og samtidig opprettholde den exosomal innhold samt deres funksjonelle immunmodulator evne. Flere metoder er blitt beskrevet for å isolere exosomes fra cellekultur og biologiske væsker 22,23. På grunn av sin lille størrelse og lave tetthet (exosomes flyte ved en tetthet på 1,15 – 1,19 g / ml), differensialultrasentrifugering og / eller ultrafiltrering er de mest vanlig anvendte teknikker for exosome isolasjon 23.Men HIV-smittede cellekultursupernatanter og pasienter 'plasma inneholde både exosomes og HIV-1 viruspartikler. Exosomes og HIV-1 partikler som er svært lik både i størrelse og tetthet. Alternativt, drar nytte av uttrykket unike exosomal markører som CD63, CD45 og CD81, exosomes har blitt isolert ved hjelp immunoaffinitetskromatografi fangst metoder 23. Denne prosedyren kan skille virus fra exosomes. Imidlertid er ulempen med denne teknikken den tette binding av antistoffene til de rensede exosomes, som kunne forstyrre vurderingen av immunmodulerende potensialet av exosomes i kultur.
For å møte disse begrensningene, har vi utviklet en prosedyre for rensing av exosomes fra HIV-partikler i humant plasma endret fra Cantin og kolleger 22 bruker Iodixanol hastighetsgradienter. Exosomes ble funnet å segregere i low-density / øvre fraksjoner av iodixanol gradienter, mens viruspartikler segregert i høy-Tetthet / lavere fraksjoner. Viruspartikler ble identifisert ved p24 ELISA og exosomes ble identifisert ved hjelp av exosome markører smerter, CD9, CD63 og CD45. De øvre lav tetthet fraksjoner oppsamlet inneholdt exosomes som var negative for HIV-1 p24 forurensning. Den effektive rensing og separering av exosomes fra HIV-partikler i humant plasma muliggjør nøyaktig undersøkelse av innholdet av exosomes avledet fra humant plasma, samt undersøkelse av deres immunmodulerende potensial og den diagnostiske og prognostiske verdi av exosomes i HIV-1 patogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kronisk aktivering av immunsystemet (CIA) og CD4 + T-celle-uttømming er to viktige kjennetegnene ved HIV-1-infeksjon. De har blitt etablert som predikator for patogenesen, med CIA å være den beste prediktor. Men de underliggende mekanismene som driver kronisk systemisk aktivering av immunsystemet og CD4 + T-celle nedgangen har fortsatt ikke fullstendig klarlagt. Vi og andre laboratorier har utviklet firmaet bevis for at exosomes utskilt fra HIV-1-infiserte celler spiller en rolle i begge kjennetegn.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
