Isolering av exosomes från plasma HIV-1 positiva individer
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Exosomes är små blåsor varierar i storlek från 30 nm till 100 nm som släpps både konstitutivt och vid stimulering från en mängd olika celltyper. De finns i ett antal biologiska vätskor och är kända för att bära en mängd olika proteiner, lipider och nukleinsyramolekyler. Ursprungligen tänkt att vara lite mer än behållare för cellrester, är roller exosomes reglerar biologiska processer och vid sjukdomar alltmer uppskattat.
Flera metoder har beskrivits för att isolera exosomer från cellulära odlingsmedia och biologiska vätskor. På grund av sin ringa storlek och låg densitet, differentiell ultracentrifugering och / eller ultrafiltrering är de vanligaste teknikerna för Exosome isolering. Men plasma från HIV-1-infekterade individer innehåller både exosomes och HIV viruspartiklar, som är lika i storlek och täthet. Således har effektiv separation av exosomes från HIV-viruspartiklar i human plasma variten utmaning.
För att ta itu med denna begränsning, har vi utvecklat ett förfarande modifierat från Cantin et. al., 2008 för rening av exosomes från HIV-partiklar i human plasma. Jodixanol hastighetsgradienter användes för att separera exosomer från HIV-1-partiklar i plasma hos HIV-1-positiva individer. Viruspartiklar identifierades genom p24 ELISA. Exosomes identifierades på basis av Exosome markörer acetylkolinesteras (AChE), och CD9, CD63 och CD45 antigener. Vår lutning förfarande gav Exosome beredningar fria från viruspartiklar. Den effektiva reningen av exosomes från human plasma möjligt för oss att undersöka innehållet i plasmabaserade exosomes och att undersöka deras immunmodulerande potential och andra biologiska funktioner.
Introduction
HIV-1-epidemin fortsätter att ha en betydande effekt i hela världen. Som av 2013, var cirka 35 miljoner människor i världen lever med hiv, och 2,1 miljoner av dessa var nyligen infekterade individer 1. Förebyggande strategier och ökad tillgång till antiretroviral behandling har varit till hjälp för att minska den totala förvärvet av HIV. Men enskilda populationer fortfarande upplever stiger i förvärvet av HIV 1. Det finns således ett behov av fortsatta insatser för att ta itu med denna epidemi.
En av de starkaste prediktorer av HIV sjukdomsförloppet är kronisk immunaktivering (CIA) 2-10. Definieras av fortsatt höga nivåer av detekterbara cytokiner och förhöjda uttrycks markörer på ytan av T-lymfocyter, har CIA skrivits: i) kontinuerlig dendritiska celler produktion av typ I IFN 11; (ii) direkta immunaktivering drivs av HIV-proteiner Tat, Nef och gp120 12; (iii) Translokation av bakteriella proteiner i tarm tillhörande immunceller 6. Den exakta mekanismen (er) underliggande kronisk, systemisk immunaktivering vid HIV-infektion ännu inte helt klarlagd.
Vår forskargrupp och andra har visat en roll exosomes i HIV patogenes 15-18. Vår grupp har fastställt att Nef-proteinet utsöndras från infekterade celler i exosomes 15, och exosomal Nef (exNef) förekommer i plasma hos HIV-infekterade individer på nanogram nivåer 18. Vi har visat att åskådare CD4 + T-celler exponerade för exNef gav aktiveringsinducerat celldöd beroende av CXCR4-vägen 19, 20. Alternativt monocyt / makrofager var refraktära till exNef apoptos, men uppvisade förändrade cellulära funktioner och cytokinexpression. Senast har vår grupp visade exosomes isolerade från plasma från HIV-infekterade individer innehåller en mängd olika pro-inflammatoriska cytokiner. Further, naiva perifera mononukleära blodceller som utsätts för plasmahärledda exosomes från HIV-infekterade patienter inducerade uttryck av CD38 på naiva och centrala minne CD4 + och CD8 + T-celler. Detta bidrar sannolikt till systemisk inflammation och virusförökning via åskådare cellsaktivering 21, och föreslår att exosomes spelar en viktig roll i HIV patogenes.
Vid undersökning roll exosomes i HIV patogenes, är en utmaning att utveckla tekniker för att på ett effektivt sätt separata exosomes från HIV-partiklar medan exosomal innehållet upprätthålla liksom deras funktionella immunmodulerande förmåga. Flera metoder har beskrivits för att isolera exosomer från cellkultur och biologiska vätskor 22,23. På grund av deras ringa storlek och låg densitet (exosomer flyter vid en densitet av 1,15 – 1,19 g / ml), differentiell ultracentrifugering och / eller ultrafiltrering är de mest allmänt använda teknikerna för Exosome isolering 23.Emellertid HIV-infekterade cellodlingssupernatanter och patienternas plasma innehåller både exosomer och HIV-1 virala partiklar. Exosomes och HIV-1-partiklar är mycket lika i både storlek och täthet. Alternativt, dra nytta av uttrycket av unika exosomal markörer såsom CD63, CD45 och CD81, exosomes har isolerats med hjälp av immunaffinitetsinfångningsmetoder 23. Detta förfarande kan separera virus från exosomes. Emellertid är nackdelen med denna teknik den täta fastsättningen av antikroppar mot de renade exosomes, som skulle kunna störa utvärderingen av den immunmodulatoriska potential exosomes i odling.
För att lösa dessa begränsningar, har vi utvecklat ett förfarande för rening av exosomes från HIV-partiklar i human plasma modifierade från Cantin och medarbetare 22 använder iodixanol hastighetsgradienter. Exosomes befanns segregera i låg densitet / övre fraktioner av jodixanol gradienter, medan viruspartiklar segregerade i hög-densitet / lägre fraktioner. Viruspartiklar identifierades genom p24 ELISA och exosomes identifierades med hjälp av Exosome markörer AChE, CD9, CD63 och CD45. De övre låg densitet uppsamlade fraktionerna innehöll exosomer som var negativa för förorening HIV-1 p24. Den effektiva rening och separering av exosomes från HIV-partiklar i human plasma möjliggör noggrann granskning av innehållet i exosomes härrör från human plasma samt undersökning av deras immunmodulerande potential och diagnostiska och prognostiska värde av exosomes i HIV-1 patogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kronisk immunaktivering (CIA) och CD4 + T-cellstömning är två viktiga kännetecken av HIV-1-infektion. De har etablerat sig som prediktorer för patogenes, med CIA är den bästa prediktorn. Men de bakomliggande mekanismerna som driver kronisk systemisk immunaktivering och CD4 + T-celler nedgång fortfarande inte helt klarlagd. Vi och andra laboratorier har utvecklat starka bevis att exosomes utsöndras från HIV-1-infekterade celler spelar en roll i båda kännetecken.
Den fortsatta intr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
