מודל עכבר לneovascularization Choroidal מושרה לייזר
Summary
Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.
Abstract
The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.
Introduction
ניוון מקולרי (AMD) הקשורות לגיל הוא אחד הגורמים המובילים לעיוורון באנשים מעל גיל 50 1-3. AMD יכול להיות מסווג לשתי צורות: מכולה ("יבש") AMD וneovascular ("רטוב") AMD. לשעבר מתאפיין בניוון גיאוגרפי של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE), choriocapillaris, וקולטניים אור, ואילו האחרונים מאופיין בפלישה של כלי חריגים מדמה העין לתוך שכבות רשתית החיצוניות גורמים לדליפה, דימום, וסיסטיק, וסופו של דבר מוביל לעיוורון 1,2. של שתי צורות, AMD neovascular מהווה את רוב הפסד 1 חזון. למרבה המזל, יש טופס זה אפשרויות ניהול רבות יעילות תרופתיות, ואילו עמיתו מכולה שלה כרגע אין מוכח טיפולים רפואיים 3. יתר על כן, בגלל צורת neovascular כבר בקלות מחדש נכנעה במודל חיה, זה כבר יותר נרחב נגיש לבסיסימחקר MD לחקור את המנגנונים פתולוגיים הבסיסיים כדי לפתח טיפולים חדשניים 4.
מודל החיה הראשון של neovascularization choroidal הניסיוני (CNV) פותח על ידי אל ריאן ואח. בפרימטים לא אנושיים 5. קרע זה מודל מושרה של הקרום של ברוך באמצעות photocoagulation לייזר, מה שגרם לתגובה דלקתית מקומית וכתוצאה מכך אנגיוגנזה דומה לזה שראה בAMD neovascular. ההתקדמות ההיסטופתולוגיים של האינדוקציה הודעה לייזר-אנגיוגנזה נמצאה לחקות neovascular AMD, אשר אישר את תקפות המודל 6. פרימטים לא אנושיים להציע את האנטומיה דומה ביותר לבני אדם, אך למרבה הצער, הם יקרים כדי לשמור, לא ניתן בקלות מניפולציות גנטית, ויש לי כמובן זמן איטי של התקדמות המחלה 7. Contrastingly, מודלים של מכרסמים הם הרבה יותר יעיל וחסכוני לשמירה, ניתן להשפיע גנטי בקלות יחסית, ויש לי הרבה יותר מהר couRSE של התקדמות מחלה (יכולים להיות שנערכו ניסויים בסולם של שבועות זמן מול חודשים). ניסויים אלה צריכים להתנהל רק במכרסמים פיגמנט כקשה מאוד לדמיין בבעלי החיים לבקן.
מודל CNV מושרה לייזר עכבר, פותח לראשונה על ידי קבוצת Campochiaro בסוף שנתי ה -90 10, גדל להיות מודל החיה הדומיננטי ברוב המחקרים שנעשה לאחרונה 11-16. בשל פתוגנזה המורכבת ועדיין לא ברורה של CNV, מודל הלייזר יושם בכל ההיבטים של מחקר רטוב AMD החל חקר המנגנונים המולקולריים הנהיגה אנגיוגנזה להערכת שיטות טיפול חדשות לשימוש בבני אדם בעתיד. לדוגמא, סקוראי et al. ואספינוסה-Heidmann et al. השתמש במודל הלייזר כדי לחקור את ההשפעה של מקרופאגים על הפיתוח של CNV באמצעות עכברים מהונדסים וטיפולים תרופתיים דלדול 15, 16. גיאני et al. וHoerster et al. טומוגרפיה אופטית קוהרנטיות משומשת (אוקטובר) לתמונת CNV במאמץ לאפיין את ההתקדמות של CNV ולהשוות את הממצאים היסטופתולוגיות לממצאים ראו בהדמית אוקטובר 12,17 מושרה לייזר. לבסוף, מחקרים שכלל הזרקת זגוגית של תרופות אנטי-angiogenic שימשו כדרישות קדם לניסויים בבני אדם והיו חיוניים בפיתוח הדור הראשון של תרופות אנטי-VEGF המשמשות בניהול neovascular היום 10,18,19 AMD.
מודלים חלופיים לCNV הניסיוני לנצל שיטות ניתוחיות לגרום CNV. הליך זה כרוך הזרקת חומרים פרו-angiogenic (למשל וקטורים ויראליים רקומביננטי ביתר VEGF, הזרקת subretinal של תאי הרשתית ו / או חרוזי פוליסטירן) לחקות את ביטוי VEGF המוגבר ראה בAMD neovascular, במטרה לגרום לאנגיוגנזה 8,20. עם זאת, שיטה זו מניבה שכיחות נמוכה יותר של אופן דרסטי neovascularization; מחקרים אלה הראו כי CNV בעכברי C57 / BL6 מתרחש ב- 31% מזריקות לעומת 70% שיעור ההצלחה ~ ראה בשיטת photocoagulation הלייזר באותו הזן של עכברים 8,14. מסיבות אלה, ובהתחשב ביתרונות של שימוש במכרסמים לעומת פרימטים לא אנושיים, מודל העכבר של CNV מושרה לייזר הפך מודל החיה הסטנדרטי של CNV לניסויי מחקר AMD neovascular ביותר 8.
עין העכבר היא רקמה זעירה, עדינה לעבוד איתו. תמרון של העין כדי להמחיש את הרשתית הוא קשה ודורש הרבה תרגול עד השליטה מושגת. משימה זו היא מסובכת על ידי העובדה שהוא חייב להיות למד עם דומיננטי והיד הלא דומיננטית. יתר על כן, לאחר התנועות העדינות הנדרשות כדי להמחיש את הרשתית כבר למדו, התיאום בין שני הידיים ודוושת רגל הפעלת הלייזר הם חשובים. במאמר זה, אנו מבקשים לזקק את האתגרים של למידה כל המניפולציות הפיזיות מעורבות בproc CNV מושרה הלייזרedure למדריך שיעזור למפעילים להשיג הצלחה מהירה עם המודל הזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם גורמים רבים שיכולים להשפיע על אספקת לייזר והתפתחות נגע CNV תוצאה לאחר לייזר אינדוקציה מוצלחת. גורמים אלה צריכים להיות מבוקרים ולטופלו על מנת לקבל את התוצאות הכי אמינות. הרלוונטי ביותר של גורמים אלה הם בחירת עכבר (גנוטיפ, גיל, ומין), בחירת חומר הרדמה, והגדרות לייזר. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.
Materials
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 gauge insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-Related Macular Degeneration. NEJM. 358, 2606-2617 (2008).
- Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
- Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
- Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
- Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
- He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
- Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
- Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
- Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
- Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
- Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
- Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
- Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
- Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
- Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
- Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
