Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

Summary

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Abstract

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Introduction

Degeneração macular (AMD) relacionada com a idade é uma das principais causas de cegueira em indivíduos com idade superior a 50 ^3/1. AMD podem ser classificados em duas formas: atrófica ("secar") e AMD neovascular ("wet") AMD. O primeiro é caracterizada por atrofia geográfica do epitélio pigmentado da retina (RPE), coriocapilar, e fotorreceptores, enquanto o último é caracterizada pela invasão de vasos sanguíneos anormais a partir do coróide para as camadas externas retinianas provocando fugas, hemorragia, e fibrose, e, finalmente levando a cegueira ^1,2. Das duas formas, DMRI neovascular representa a maioria da perda de visão ^1. Felizmente, essa forma tem inúmeras opções eficazes de gestão farmacológicas, ao passo que o seu homólogo atrófica não tem comprovada tratamentos médicos ^3. Além disso, porque a forma neovascular foi facilmente re-capituló num modelo animal, que tem sido mais amplamente acessível a um básicaPesquisa MD explorar os mecanismos patológicos subjacentes, a fim de desenvolver novas terapias ^4.

O primeiro modelo animal experimental de neovascularização coroidal (CNV) foi desenvolvido por Ryan et al. em primatas não humanos ^5. Esta ruptura induzida modelo de membrana de Bruch através fotocoagulação por laser, o que provocou uma resposta inflamatória local na angiogénese resultante semelhante ao observado em DMRI neovascular. A progressão histopatológico de angiogênese indução de pós-laser foi encontrado para imitar neovascular AMD, que confirmou a validade do modelo ^6. Os primatas não humanos oferecem a anatomia mais semelhantes aos seres humanos, mas, infelizmente, são caros de manter, não pode ser facilmente manipulado geneticamente, e tem um curso lento tempo de progressão da doença ^7. Em contraste, os modelos de roedores são muito mais para manter a relação custo-eficácia, pode ser geneticamente manipulados com relativa facilidade, e têm um muito mais rápido course de progressão da doença (experiências pode ser conduzida numa escala de tempo de semanas contra meses). Estas experiências só devem ser realizados em roedores pigmentadas, uma vez que é muito difícil de visualizar em animais albinos.

O modelo CNV induzido por laser do mouse, primeiro desenvolvido pelo grupo Campochiaro no final dos anos 90, ^10, tem crescido a ser o modelo animal dominante na maioria dos estudos recentes ^11-16. Devido à patogénese complexo e ainda não está claro da CNV, o modelo de laser foi aplicado em todos os aspectos da investigação AMD molhado variando de estudar os mecanismos moleculares que conduzem a angiogénese para avaliar novas modalidades de tratamento para futuro uso humano. Por exemplo, Sakurai et al. e Espinosa-Heidmann et ai. utilizado o modelo de laser para investigar o efeito de macrófagos no desenvolvimento de CNV utilizando ratinhos transgénicos e tratamentos farmacológicos exaustão ^{15, 16.} Giani et ai. e Hoerster et ai. usado óptico de tomografia de coerência (OCT) para a imagem da CNV em um esforço para caracterizar a progressão da CNV e comparar os achados histopatológicos com os resultados vistos em outubro imagem ^12,17 induzida por laser. Finalmente, estudos envolvendo injeção intravítrea de agentes anti-angiogênicos têm sido usados ​​como pré-requisitos para testes em humanos e foram vitais no desenvolvimento da primeira geração de agentes anti-VEGF utilizados na gestão de DMRI neovascular hoje ^10,18,19.

Modelos alternativos para CNV experimental utilizam métodos cirúrgicos para induzir a CNV. Este procedimento envolve a injecção de substâncias pró-angiogénicas (por exemplo, vectores virais recombinantes que sobre-expressam o VEGF, a injecção sub-retiniana de células EPR e / ou pérolas de poliestireno) para simular o aumento da expressão de VEGF na DMRI neovascular visto, com o objectivo de causar a angiogénese ^8,20. No entanto, este método produz uma incidência drasticamente menor de neovascularização; estes estudos mostraram que na CNVC57 / BL6 ratos ocorre em 31% de injecções de 70% contra a taxa de sucesso ~ visto no método de fotocoagulação com laser na mesma estirpe de ratinhos ^8,14. Por estas razões, e tendo em conta as vantagens do uso de roedores contra primatas não-humanos, o modelo de ratinho de CNV induzido por laser tornou-se o modelo animal padrão de CNV para a maioria experiências de estudo AMD neovascular ^8.

O olho do rato é um tecido minúsculo, delicado para trabalhar. Manobras do olho de visualizar a retina é difícil e requer muito prática até que seja alcançado o domínio. Esta tarefa é complicada pelo facto de que deve ser aprendido com a mão dominante e não-dominante. Além disso, após os movimentos finos necessários para visualizar a retina foram aprendidas, a coordenação entre ambas as mãos ea pedal operar o laser são importantes. Neste trabalho, buscou-se destilar os desafios de aprender todas as manipulações físicas envolvidas no CNV proc induzida por laseredure em um guia que iria ajudar as operadoras a alcançar o sucesso rápido com este modelo.

Protocol

Todos os animais são tratados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 2013 Edition, da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em Oftalmologia e Vision Research, e conforme aprovado pelo animal Institucional Cuidado e Utilização Comité para a Universidade de Northwestern. Nota: O procedimento que se segue pode ser feito inteiramente com um operador; No entanto, é muito mais eficientemente conduzida com dois op…

Representative Results

Quantificação de lesões de NVC pode ser realizado através da análise da coróide planas montadas usando coloração por imunofluorescência para rotular os vasos NVC. Os dois métodos mais utilizados de preparação do tecido são rotulagem FITC-dextrano, feito através de perfusão imediatamente antes do sacrifício animal, ou post-mortem imuno-coloração com um marcador de células endoteliais. Ambos os métodos foram descritos anteriormente em detalhe 13,14,21; figuras 1 e 2<…

Discussion

Existem vários fatores que podem afetar a entrega do laser e do desenvolvimento resultante da lesão CNV após laser de indução bem-sucedida. Estes factores devem ser controlados e padronizados para a fim de ter os resultados mais fiáveis. O mais pertinente desses fatores são a seleção do mouse (genótipo, idade e sexo), a seleção anestésico, e as configurações de laser.

O modelo de mouse específico usado pode ter um efeito significativo sobre o curso do desenvolvimento CNV. O g…

Materials

532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 gauge insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis