Summary

Модель мышь для лазерно-индуцированной неоваскуляризации хориоидеи

Published: December 27, 2015
doi:

Summary

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Abstract

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Introduction

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является одним из ведущих причин слепоты у лиц в возрасте старше 50 1-3. AMD могут быть классифицированы в двух формах: атрофический ("сухой") AMD и неоваскулярная ("мокрый") драмов. Первая характеризуется географической атрофии пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), choriocapillaris, и фоторецепторов, в то время как последний характеризуется вторжением аномальных сосудов от сосудистой оболочки в наружных слоях сетчатки вызывает утечки, кровотечение, и фиброз, и в конечном итоге приводит к слепоте 1,2. Из двух форм, неоваскулярной ВМД составляет для большинства потери зрения 1. К счастью, эта форма не имеет многочисленные эффективные варианты фармакологические управления, в то время как его коллега атрофический в настоящее время имеет не доказано медицинского лечения 3. Кроме того, поскольку неоваскулярная Форма легко повторно капитулировали на животной модели, он был более широко доступным для основной АИсследование MD изучения основополагающих патологические механизмы для того, чтобы развивать новые методы лечения 4.

Первая модель животных экспериментальной хориоидальной неоваскуляризации (CNV) была разработана Райан и др. в нечеловеческих приматов 5. Эта модель индуцированного разрыв мембраны Бруха с помощью лазерной коагуляции, которая вызвала местной воспалительной реакции в результате ангиогенеза, аналогичной видели в неоваскулярной ВМД. Гистопатологическая прогрессирование ангиогенеза после лазерной индукции был найден, чтобы имитировать неоваскулярной драмов, что подтвердил законность в модели 6. Номера для человека приматов предложить наиболее похожий анатомии человека, но, к сожалению, являются дорогими в обслуживании, не может быть легко генетически модифицированных, и у вас медленный ход времени прогрессирования заболевания 7. Контрастно, модели грызунов являются гораздо более экономически эффективным для поддержания, может быть генетически манипулировать с относительной легкостью, и имеют гораздо быстрее КоуРГП прогрессирования заболевания (эксперименты могут проводиться на временной шкале недель против месяцев). Эти эксперименты должны проводиться только в пигментных грызунов, поскольку это очень трудно представить себе в альбиносов животных.

Мышь лазерно-индуцированный модель ЦНВ, впервые разработанная группой Campochiaro в конце 90-х 10, выросла в доминирующей моделью для животных в большинстве последних исследований 11-16. Из-за сложной и до сих пор неясно патогенезе CNV, лазер модель была применена во всех аспектах исследования мокрой AMD, начиная от изучения молекулярных механизмов ангиогенеза вождения к оценке новых методов лечения в будущем человеческого использования. Например, Sakurai и др. и Эспиноса-Heidmann др. используется лазерный модель для изучения влияния макрофагов на развитие ХНВ с использованием трансгенных мышей и фармакологические методы лечения истощения 15, 16. Джани др. и др Hoerster, б оптико-когерентной томографии (ОКТ) к изображению лазер-индуцированной ЦНВ в попытке охарактеризовать прогрессирование ХНВ и сравнить гистопатологические выводы результатами исследований на ОКТ изображений 12,17. Наконец, исследования с участием инъекции в антиангиогенных агентов были использованы в качестве предпосылок для испытаний на людях и были жизненно важное значение в разработке первого поколения анти-VEGF средств, используемых в управлении неоваскулярной AMD сегодня 10,18,19.

Альтернативные модели экспериментальной CNV использовать хирургические методы, чтобы побудить CNV. Эта процедура предполагает введение проангиогенные веществ (например рекомбинантными вирусными векторами с гиперэкспрессией VEGF, субретинальная инъекции RPE клеток и / или гранул полистирола), чтобы имитировать повышенную экспрессию VEGF видно на неоваскулярной ВМД, с целью нанесения ангиогенез 8,20. Тем не менее, этот метод дает значительно меньшую частоту неоваскуляризации; Эти исследования показали, что CNV вС57 / BL6 мышей происходит в 31% по сравнению с инъекциями ~ 70% успеха видели в методе лазерной коагуляции в том же духе мышей 8,14. По этим причинам, а также учитывая преимущества использования грызунов по сравнению с не-приматов, модель мышь лазерно-индуцированной CNV стала стандартной модели животных ХНВ для большинства экспериментов неоваскулярных 8 учебных AMD.

Глаз мыши представляет собой незначительный, тонкий ткань работать. Маневрирование глаза, чтобы визуализировать сетчатку трудно и требует много практики, пока мастерство не будет достигнута. Эта задача осложняется тем, что он должен быть извлечены с доминирующей и не доминирующей рукой. Кроме того, после того, как мелкие движения, необходимые для визуализации сетчатки были извлечены, координация между обеими руками и педали операционной лазер важны. В этой статье, мы стремились, чтобы отогнать проблемы обучения всех физических манипуляций, участвующих в лазерно-индуцированной CNV прокedure в руководстве, что бы помочь операторам добиться быстрого успеха с этой моделью.

Protocol

Все животные лечатся в соответствии с Руководством по части уходу и использованию лабораторных животных 2013 издание, Ассоциация по исследованиям в видении и офтальмологии (ARVO) Заявление для использования животных в офтальмологических и Vision Research, и, как утверждается институциональной ?…

Representative Results

Количественная оценка CNV поражений может быть выполнена путем анализа плоских монтажа сосудистой оболочки глаза с помощью иммунофлуоресцентного маркировать сосуды Cnv. Два наиболее часто используемые методы подготовки ткани FITC-декстран маркировка, осуществляется с помощью перфузии ?…

Discussion

Есть несколько факторов, которые могут повлиять на лазерный доставку и результирующий развития CNV поражения после успешного лазерной индукции. Эти факторы должны контролироваться для стандартизированы и для того, чтобы иметь наиболее надежные результаты. Наиболее близким из этих фак…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.

Materials

532 nm (green) argon ophthalmic laser IRIDEX GLx any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp Carl Zeiss 30SL-M any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol Sigma T48402-25G used to make anesthetic
tert-amyl alcohol Sigma 152463-1L used to make anesthetic
amber glass vials + septa Wheaton WH-223696 tribromoethanol storage
tissue wipes VWR 82003-820 miscellaneous 
1% tropicamide Falcon Pharmaceuticals RXD2974251 pupillary dilation
0.5% tetracaine hydrochloride Alcon  0065-0741-12 topical anesthesia
artificial tears Alcon  58768-788-25 hydration
heat therapy pump (for animal warming) Kent Scientific HTP-1500 used to maintain animal body temp
warming pad Kent Scientific TPZ-0510EA maintains animal body temperature
30 gauge insulin needles BD 328418 IP anesthesia injection
scale American Weigh Scale AWS-1KG-BLK mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm) VWR 48366089 flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine obtained from institution obtained from institution anesthesia
ketamine obtained from institution obtained from institution anesthesia
Volocity PerkinElmer used for volumetric re-construction
ImageJ National Institutes of Health used for image analysis

References

  1. Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).
  2. Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
  3. Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-Related Macular Degeneration. NEJM. 358, 2606-2617 (2008).
  4. Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
  5. Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
  6. Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
  8. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
  9. Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
  10. Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
  11. He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
  12. Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
  13. Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
  14. Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
  15. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
  16. Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
  17. Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
  18. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
  19. Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
  20. Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
  21. Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
  22. Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
  23. Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
  24. Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
  25. Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
check_url/53502?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J. Vis. Exp. (106), e53502, doi:10.3791/53502 (2015).

View Video