En strategi at validere rolle Callose-medieret Plasmodesmal gating i Tropic svar

Summary

Denne artikel beskriver metoderne til screening af gener, der kontrollerer plasmodesmal permeabilitet og dermed auxin gradient under tropiske respons. Dette omfatter måling af graden af ​​tropiske respons i hypokotyle af Arabidopsis thaliana og kontrol plasmodesmal permeabilitet med 8-hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsyre (HPTS) lastning og vurdering endelig callose niveau.

Abstract

Anlægget hormon auxin spiller en vigtig rolle i mange vækst- og udviklingsprocesser, herunder tropiske reaktioner på lys og tyngdekraft. Etableringen af ​​en auxin gradient er en central begivenhed, der medfører fototropisme og gravitropism. Tidligere blev polar auxin transport (PAT) vist at etablere en auxin gradient i forskellige cellulære domæner af planter. Men Han et al. Nylig vist, at for korrekt auxin gradient dannelse, plasmodesmal callose-medieret symplasmic konnektivitet mellem de tilstødende celler er også en kritisk faktor. I dette manuskript, til den strategi, belyse den rolle, bestemte gener, som kan påvirke fototropisme og gravitropism ved at ændre symplasmic tilslutning via modulerende plasmodesmal callose syntese, diskuteres. Det første skridt er at screene afvigende tropiske svar fra 3 dage gamle etiolerede frøplanter af mutanter eller over-udtryk linjer af et gen sammen med den vilde type. Denne indledende screeningkan føre til identifikation af en række gener fungerer i PAT eller kontrollerende symplasmic tilslutningsmuligheder. Den anden screening indebærer sortering af kandidater, der viser ændrede tropiske svar ved at påvirke symplasmic tilslutningsmuligheder. For at imødegå sådanne kandidater, blev bevægelsen af ​​en symplasmic sporstof og aflejring af plasmodesmal callose undersøgt. Denne strategi vil være nyttigt at udforske nye kandidatgener, der kan regulere symplasmic konnektivitet direkte eller indirekte under tropic svar og andre udviklingsprocesser.

Introduction

Planter, som sessile levende organismer, har udviklet en meget avanceret netværk af celle-til-cellesignalering at løse forskellige miljømæssige stimuli. Tropic responser er en af ​​de fænomener, som planter reagerer på miljømæssige stimuli. Planter viser to vigtigste tropiske svar, fototropisme og gravitropism. Fotosyntetiske planter bøje mod lyskilden ved fototropisme at høste maksimal energi. Tilsvarende gravitropism gør planterne at vokse mod tyngdepunkt. Den grundlæggende mekanisme, der fører til sådanne tropiske reaktioner involverer asymmetrisk gradient dannelse af phytohormonet auxin ^en. Det handler om lokale auxin gradient dannelse er godt karakteriseret; de gener, der er involveret i denne mekanisme giver en køreplan for hormon handling ^2-8. Den specifikke placering af auxin efflux bærere, såsom PIN-formed (PIN) og p-glycoproteiner, udfører bevægelsen af auxin fra cytoplasmaet til cellevæggen af donorceller ^9,10. Furthermore, ved den aktive H ⁺ / IAA symport aktivitet af auxin tilstrømning bærere, såsom AUX1 / LAX familie proteiner, auxin er endelig leveret til de tilstødende modtager celler ^2,11,12. Denne retningsbestemt bevægelse af auxin er kendt som polar auxin transport (PAT). PAT fører til en differentiel auxin fordeling under forskellige udviklingsstadier og som reaktion på forskellige miljømæssige stimuli ^13,14. Desuden afbrydelse i lokalisering eller ekspression af nogen af ​​disse auxin indstrømning eller efflux bærere fører til alvorlig ændring i PAT, som forårsager en afbrydelse af den auxin-gradient, hvilket fører til udviklingsmæssige defekter. For nylig, Han et al. rapporterede, at plasmodesmal forordning er også nødvendig for at opretholde auxin gradient ^15. Til dato har mere end 30 plasmodesmal proteiner blevet identificeret ^16. Blandt disse proteiner har AtGSL8 blevet rapporteret som et centralt enzym til callose syntese ved plasmodesmata (PD), og derfor spiller en afgørende rolle i maintaining grænse PD udelukkelse størrelse (SEL). Undertrykt AtGSL8 udtryk resulterede i en forvrænget auxin gradient mønster fører til ingen tropiske respons i modsætning til vildtype kimplanter ^15.

I dette manuskript, metoder udforske nye kandidatgener, der er involveret i PD regulering leveres. AtGSL8 blev anvendt som en model protein for at teste disse metoder, da det er et vigtigt enzym bidrager til PD callose biosyntese. På grund af den kimplante-letalitet gsl8 knock-out mutanter ^17, blev dexamethason (dex) inducerbare RNAi linjer anvendes i overensstemmelse med en tidligere offentliggjort rapport ^15. Oplysningerne her strategi kan tilpasses til at screene gener, der er impliceret i hypokotyle tropic respons kontrolleret af PD SEL.

Protocol

1. Screening af mutanter med ændret fototropisk og Gravitropic Responses

1. Forbered 1x Murashige og Skoog (MS) Medium, pH 5,7, med 0,8% Agar en dag før forsøget.
   1. Tilsættes 800 ml dobbelt destilleret vand til en 2 L konisk kolbe og omrøres med en magnetisk stang.
   2. Tilføj 4,4 g MS salt til den koniske kolbe.
   3. Tilsæt 0,5 g 2- (N-morpholino) ethansulfonsyre (MES) og omrør indtil alle saltene er fuldstændig opløst.
   4. Justere mediets pH til 5,7 med 1 M KOH.
   5. Overfør mediet til en masse cylinder og bringe endelige volumen til 1 l med Hedeselskabet ₂ O.
   6. Hæld tilbage mediet i en 2 L konisk kolbe, og der tilsættes 8 g plante agar.
   7. Wrap munden på den koniske kolbe stramt med aluminiumsfolie.
   8. Autoklaver MS-medium og Hedeselskabet ₂ O i 15 minutter ved 121 ° C, 15 psi, og efter autoklavering, holde mediet i en 60 ° C inkubator og Hedeselskabet ₂ O ved stuetemperatur.
   9. Efter afkøling til 60 ° C, hældes mediet i 125 x 125 x 20 mm ³ kvadratiske plader på en laminar strømning bænk (50 ml i hver plade).
   10. Tillad agaren at størkne ved stuetemperatur i ca. 1 time ved at holde pladerne delvis åben. Hvis pladerne ikke anvendes straks, forsegle dem ved hjælp plastfolie og opbevares ved 4 ° C i køleskab.
2. Overflade-sterilisere frøene med 1,1% natriumhypochlorit og dot frø på 1x MS agarplader, der blev udarbejdet i afsnit 1.1.
   Bemærk: Her Arabidopsis thaliana {Col-0 frø, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ anvendes til tropisk respons, callose farvning og HPTS lastning Arabidopsis thaliana {Col-0 og dsGSL8 (Col-0) EMS mutant} frø (. upubliceret) anvendes til tropic respons i figur 2.
   1. Autoklaver 300 ml Hedeselskabet ₂ O i en flaske.
   2. Der tilsættes ca. et hundrede frø for hvert baggrund, dvs,mutant / overekspression linje og vildtype (Col-0) frø, til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
   3. Tag 1x MS agarplader fra et 4 ° C køleskab og tør dem på en laminar strømning bænk i en delvis åben stilling.
   4. Overflade-sterilisere frøene ved tilsætning af 1 ml af en 0,2x blegemiddelopløsning (1,1% natriumhypochlorit) og holder mikrocentrifugerør på rysteapparat ved 250 rpm i 5 min.
   5. Lad frøene afregne til bunden af ​​tyngdekraften og derefter fjerne blegemiddel løsning ved mikropipette.
   6. Der tilsættes 1 ml frisk Hedeselskabet ₂ O (autoklaveret) til frøene og bland godt ved at vende mikrocentrifugerør flere gange. Lad frøene bosætte igen og derefter fjerne vandet.
   7. Gentag trin 1.2.6 5-6 gange.
   8. Tilføj dobbelt så meget vand til volumenet af frøene, der var tilbage efter den endelige vask.
   9. Dot de steriliserede frø på en semi-tørret 1x MS agarplade med en 1 ml mikropipette tip indeholdende 200 pi frø (icluding vand).
      1. Holde ca. 0,1 cm afstand mellem to frø og et minimum på 1,8 cm mellem to frø rækker. Dot frøene i fem vandrette rækker per kvadrat plade (125 x 125 x 20 mm ^3). Lad vandet tørre lidt før placere låget på pladen.
   10. Forsegl pladerne med kirurgisk tape, stak alle pladerne lodret, og wrap med alufolie.
   11. Overfør de indpakkede plader til en mørk boks (uden adgang for lys). Derefter holder den mørke kasse i et 4 ° C rum / køleskab i 3 dage.
   12. Begyndende fra dette trin, holde retningen af ​​plader uændrede. Efter 3 dages kuldebehandling, holde den mørke kasse i en plante kultur rum ved 22 ° C i de næste 3 dage. Efter 3 dage, kontrollere spiring status af frøene under grønt lys i et mørkt rum.
       BEMÆRK: Normalt tre dage gamle Col-0 etiolerede kimplanter kan vokse op til 1,6 cm i længden.
3. Analysere ændret fototropisk ennd gravitropic respons i mutanter eller overekspression linjer af et specifikt gen. Kun vælge samme størrelse og vertikalt dyrkes lige kimplanter under grønt lys i et mørkt rum. Overfør udvalgte kimplanter til et frisk 1x MS agarplade med spidsen af ​​en steriliseret tandstikker.
   1. Vælg forsigtigt frøplanter fra den nederste del af deres hypokotyle uden at røre andre dele. Sørg for, at alle de planter har samme kimblad / krog orientering, og efter overførsel, at orienteringen af ​​sætteplante kroge forbliver de samme. Brug mindst 20 frøplanter af hver baggrund i hver række og mindst to plader for hvert tidspunkt til yderligere analyse.
      Bemærk: Fire forskellige baggrunde kan sammenlignes i hver plade (4 rækker).
      Valgfrit: Mens du bruger dexamethason (dex) inducerbare RNAi / over-udtryk linjer, overføre de ovennævnte planter til en 1x MS plade sammen med + dex MS plade (plade indeholdende 1x MS, 0,8% agar medium suppleret med 20 pM dex) for 3 timer og holde pladerne lodret i mørkt felt.
   2. For at kontrollere fototropisk respons, overføre de ovennævnte plader lodret til en sort boks med kun den ene side åbnes. Overfør den sorte boks holdige plader til en plante vækstkammer med ensidig hvidt lys. At sikre ensidig lys, placere kanten af ​​pladen mod lyskilden (ikke forsiden). Se opsætningen i figur 1.
   3. Ligeledes at kontrollere gravitropic reaktion, holde pladerne med overførte kimplanter lodret, og dække med aluminiumsfolie. Dernæst ændre pladen orientering lodret til 90 ° og holde det inde i det sorte boks dækket fra alle sider. Se opsætningen i figur 1.
   4. Efter de givne tidspunkter, (normalt 1,5 timer, 3 timer, 6 timer og 12 timer) scanne pladerne med en scanner, og gemme billeder i JPEG-format.
   5. Mål bøjningsvinklen af kimplanter hjælp ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Start ImageJ programmet ved at dobbeltklikke (figur 2A).
         Bemærk: De store værktøjer, der blev brugt i målingen vinkel er vist i figur 2B.
      2. Klik på "fil" valgmulighed efterfulgt af sub-option "åbne" i ImageJ værktøjslinjen og åbne billeder, der er gemt i JPEG-filformat til at måle tropic bøjningsvinkel (Figur 2C).
      3. Klik på forstørrelsesglasset for at zoome ind eller ud på billedet ved at klikke på venstre eller højre museknap, henholdsvis som vist i figur 2B.
      4. Klik på rulle værktøj til at trække og placere billedet (figur 2D) .Næste, klik vinklen værktøj til at måle vinklen på bøjning (Figur 2E).
         1. Lav en dobbelt venstre klik på den oprindelige hypokotyle voksende retning punkt "a", trække musen til det bøjning indledning point 'b' (figur 2F), og klik på venstre røvpå at trække den første linje (figur 2G).
         2. Træk musen fra punkt B til bøjning slutpunktet 'c', og klik på venstre knap for at trække den anden linje (Figur 2H) og danner en fast A. Bemærk: Den sande bøjning vinkel er B, som er lig med 180 ° - A. (figur 2F).
         3. Mål og optage A ved at trykke på 'M' på tastaturet. Resultatet fil åbnes separat som vist i figur 2I. Mål og registrere alle de kimplanter én efter én. F.eks første måling af bøjningsvinkel for alle de kimstængler fra Col-0 og derefter for mutante linjer.
   6. Overfør datasættet fra ImageJ til regneark fil for at gøre avnemsnit af bøjning vinkler på hver baggrund.
   7. Til kvantitativ analyse gør et søjlediagram diagram med statistiske testresultater, herunder standardfejllinjer og sandsynlighedsfordelinger værdier (se Figur 2).
      1. Beregn den sande bøjning B, og designe en formel ved hjælp regneark, dvs. B = 180 ° - En note: A er den værdi, der er afledt af ImageJ analyse.
      2. Mål den gennemsnitlige ombøjningsvinkel B for hver baggrund ved hjælp af regneark værktøjer (Figur 2J).
      3. Analyser standardafvigelsen mellem replikater for hver måling ved hjælp af regnearket "formler" værktøj (Figur 2J).
      4. Test SIGsentlig resultaterne ved at anvende en t-test til den gennemsnitlige bøjningsvinkel og standardafvigelsesværdier beregnet som nævnt ovenfor.
      5. Tegn et søjlediagram til ovenstående værdier til grafisk repræsentere den kvantitative forskel i bøjning vinklen mellem to forskellige baggrunde hjælp regnearket "indsættes" værktøj (figur 2K).
         Bemærk: Mutant / over-udtryk linjer af stærke kandidatgener ville vise tydelige forskelle med hensyn til vildtype, såsom ingen bøjning, hurtig bøjning eller langsom bøjning.

2. Screen Plant Lines med Defekt Tropic Responses følge af ændringer i PD SEL med en ændret PD Callose Level

1. Udfør en hypokotyle Loading Assay med 8-hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsyre (HPTS) Dye Loading på toppen af stiklinger med HPTS Agarose Blocks og sammenlign den Bevægelse af Dye Mellem Mutant / overekspression Linjer og Col-0.
   1. Forbered HPTS AgaroSE blokke til kimstænglen loading assayet.
      1. Tag 10 ml Hedeselskabet ₂ O i en 50 ml konisk kolbe og tilsættes 0,1 g agarose til fremstilling af en 1% agarosegel. Kog agarose i en mikrobølgeovn for 1-2 min med intermitterende rystning, og lad den køle af i 5 min.
      2. Tilføj 50 mg HPTS til 10 ml 1% agarose løsning, og bland godt indtil opløsningen bliver grøn.
      3. Hæld den ovennævnte blanding til en 10 mm petriskål, og lad det størkne i 15 min.
      4. Skær størknede HPTS agarose med en skarp dissektion kniv til at foretage små agarose blokke (0,5 x 2 cm ^2).
   2. Forbered plante prøver for HPTS farvestof-loading assay.
      1. Indstil en platform for HPTS farvestof lastning assay; placere et mikroskop dækglas (24 x 50 mm ²⁾ om nye MS-medium plade som vist i figur 3A.
      2. Forbrugsafgifter 3 døgn gamle etiolerede kimplanter fra bunden af ​​krogen ved hjælp af en skarp kirurgisk saks.
      3. Straksoverføre de ovennævnte frøplanter (mindst 5 kimplanter fra hver baggrund) til overfladen af ​​et mikroskopisk dækglas på en sådan måde, at kun 0,5 cm hypokotyle fra udskæringen position bør forblive på dækglas, og resten af ​​kimstænglen bør røre mediet, som vist i figur 3B.
      4. Placer HPTS agarose blok oven kimstænglen (med en udskåret krog) i 5 minutter på en sådan måde, at det udskårne område rører HPTS agarose blok.
      5. Efter 5 min læsning, fjerne agarose blok fra hypokotyle overflade, overføre kimstænglerne til 10 mm petriskål indeholdende Hedeselskabet ₂ O og vask kimstængler i Hedeselskabet ₂ O i 15 min under stadig omrystning.
   3. Forbered Prøver til konfokal mikroskopi.
      1. Vælg mindst 5 kimplanter fra hver baggrund for observation under konfokal laser scanning mikroskop.
      2. I laser kanal indstilles bølgelængden til 488 nm for specifik excgrænsning og 500 til 550 nm for band-pass emission.
      3. Overfør frøplanter i 2 sæt (en Col-0 + en mutant) til en ny mikroskoppræparatet efter vask med Hedeselskabet ₂ O. Tilføj 100-150 pi dobbelt-destilleret vand til dias, og dække med et låg dias. Skift dias til det stadium af konfokal mikroskop.
      4. Fokus kimstængelområdet (med en 20X eller 40X objektiv) ved hjælp af lys-felt (hvidt lys) belysning. Derefter scanne dias til fluorescens.
      5. Tag billeder i minimum 10 sæt, og sammenligne de to baggrunde ved at kontrollere omfanget af farvestof bevægelse fra et lastning.
         Bemærk: Mutant / over-udtryk linjer med ændret symplasmic bevægelse vil vise forskellige mønstre af farvestof belastning sammenlignet med vildtype Col-0.
2. Analyser Callose niveau i Mutant / overekspression Lines Viser Ændret fototropisk og Gravitropic respons og Viser Distinct HPTS Dye Movement Compared til Col-0.
   1. Forbered anilin blå callose farvning farvestof.
      1. Lav 1 M glycin, pH 9,5 og 0,1% (W / V) anilin blå i autoklaveret Hedeselskabet ₂ O.
      2. Gør farvningen buffer ved blanding af 0,1% anilin blå og 1 M glycin i 2: 3 volumenforhold. For eksempel til 50 ml farvning puffer, tage 20 ml 0,1% anilin blå og 30 ml 1 M glycin. Bemærk: Kontroller, farvning buffer mindst 48 timer før brug og gemme det i mørke.
   2. Stain bøjet eller ikke-bøjet frøplanter med callose-specifik anilin blåt farvestof.
      1. Til hæmning af de novo callose syntese under farvningen processen, tilsæt slutvolumen på 1,5 mM 2-deoxy-D-glucose (DDG) til 50 ml farvning puffer.
      2. Tag 3 dage gamle etiolerede kimplanter til callose farvning (med eller uden tropisk respons).
      3. Skær frøplanter fra deres krog region ved hjælp af tynde kirurgiske sakse.
      4. Overfør de planter i en lille petriskål indeholdering 2 ml farvning puffer med spidsen af ​​en tandstikker.
      5. Inkubér frøplanter med farvning puffer i mørke i 2 timer under stadig omrystning ved 30 rpm.
      6. Efter farvning, vask frøplanter med Hedeselskabet ₂ O i 2 min for at fjerne overskydende farvning buffer.
      7. Vælg mindst 5 plantemateriale til hver plante baggrund for observation under konfokal laser scanning mikroskop.
   3. Fremstille prøver til konfokal mikroskopi:
      1. Overfør de planter i sæt (én Col-0 + en mutant) at rense objektglas efter vask med Hedeselskabet ₂ O.
      2. Tilføj 100-150 pi af Hedeselskabet ₂ O og tildækkes med en cover dias. Skift dias til det stadium af konfokal mikroskop.
      3. I en laser kanal, indstilles bølgelængden til 405 nm for specifik excitation og 500 til 550 nm emission for billeddannelse af anilin blå fluorescens.
      4. Bring kimstængelområde i fokus, først med 10X og sentr med 20x eller 40X objektive linser ved hjælp af lys-felt (hvidt lys) belysning.
      5. Derefter tænde filtreret lys, scanne dias for fluorescens, og gemme billederne.
      6. Mål callose signalintensitet med ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (se figur 4).
         1. Ændre formatet på konfokal mikroskopi billeder fra Olympus billede binært format (* .oib) til JPEG-filformat. Bemærk: Kun JPEG-format understøttes af ImageJ software.
         2. Start ImageJ programmet ved at dobbeltklikke (figur 4A). Bemærk: Pile viser rektanglet værktøj til brug i callose intensitet måling (figur 4B).
         3. Klik på "fil" valgmulighed efterfulgt af sub-option "åbne" i ImageJ værktøjslinjen og åbne mikroskopi billeder, der blev reddet i JPEG-filformat til at måle callose intensitet (figur 4C).
         4. Klik på rektangulære ikon på ImaGEJ værktøjslinjen (figur 4D).
         5. For at analysere signal intensitet, trække markøren over billedet og vælge det område, der skal undersøges (Figur 4E)
         6. Mål og registrere de numeriske værdier for signal intensitet ved at trykke på "M" på tastaturet (figur 4E). Bemærk: Resultatet fil åbnes separat (Figur 4F).
         7. Mål og registrere intensiteten værdier en efter en for alle de planter fra hver plante baggrund.
            Bemærk: I ImageJ, resultatet filen "Mean" angiver signalet intensiteten af ​​den valgte "område".
      7. Kopier middelværdierne fra ImageJ resultat filen, og indsæt i regneark fil til kvantitativ analyse.
      8. Til kvantitativ analyse gøre et søjlediagram diagram med statistiske tests, herunder standardfejllinjer og sandsynlighedsværdier (figur 4).
         1. Mål den gennemsnitlige signalintensitet(gennemsnit fra ImageJ) for hver baggrund ved hjælp af regnearket "formler" værktøj (figur 4G).
         2. Analyser standardafvigelsen mellem replikater for hver måling ved hjælp af regnearket "formler" værktøj (figur 4G).
         3. Beregn standardafvigelse (SE) hjælp thespreadsheet "formler" værktøj.
            Bemærk: Se = s / √ n, hvor (e) er standardafvigelsen af befolkningen, og (n) er størrelsen (antal observationer) af prøven.
         4. Test betydningen af ​​resultaterne ved anvendelse af en t-test til den gennemsnitlige signalintensitet og standardfejlværdier beregnet som nævnt ovenfor.
         5. Tegn et søjlediagram diagram ved hjælp af ovenstående værdier, grafisk repræsentere den kvantitative forskel i callose niveau mellem to forskellige baggrunde hjælp regnearket "indsættes" værktøj (Figur 4H).
            Bemærk: Mutant / over-udtryk linjer af stærke kandidater vil shvordan forskellige niveauer af callose sammenlignet med vildtype, såsom ingen callose, lille callose eller hyper PD callose akkumulation.

Representative Results

I den nuværende setup, dexamethason (dex) inducerbare RNAi linjer af AtGSL8 [herefter dsGSL8 (+ k s / -dex)] blev anvendt, som homozygot gsl8 T-DNA indsættelse mutanter er sætteplante dødbringende ^18. Tre dage gamle etiolerede frøplanter af dsGSL8 og vild type frøplanter med ± dex blev udsat for fototropisk og gravitropic stimuli. Vi fandt, at dsGSL8 (+ dex) kimplanter var defekte i fototropisme og gravitropism ^15. Figur 5 viser klart, at dsGSL8 (+ dex) udviser ingen bøjning under påvirkning af både fototropisme og gravitropism. Desuden ændring i symplasmic bevægelse i dsGSL8 (+ dex) og dsGSL8 (-dex) eller Col-0 blev analyseret ved en HPTS lastning assay. I overensstemmelse med vores tidligere fund, at HPTS farvestof bevægelse i dsGSL8 (+ dex) var betydeligt mere omfattende end i dsGSL8 (-dex) eller Col-0, figur 6. Callose er en af de vigtigste regulatorer af PD SEL, og AtGSL8 er kendt som en PD callose syntase ^16. Endvidere blev callose anilin blåfarvning udført, og dsGSL8 (+ dex) har vedvarende vist en lav PD callose niveau før og efter tropic reaktioner, som vist i figur 7.

Figur 1. Flow diagram af de skridt, der er involveret i stimulering af fototropisk og gravitropic svar. (A) Transfer lodret vokset kimplanter fra forskellige plante baggrunde til én plade, men i separate linjer. (B) For fototropisme, holde pladerne vender mod ensidig hvidt lys i en mørk boks, der er åbnet på den ene side. For gravitropism, første wrap pladerne med aluminiumsfolie, rotere 90 °, og overføre til en mørk boks (covered fra alle sider). (C) Ved hjælp af en scanner, scanne pladerne efter forskellige tidsintervaller, såsom 1,5 timer, 3 timer, 6 timer og 12 timer. (D og E) Disse paneler viser datagenerering fra ImageJ og dataanalyse ved hjælp regnearksfiler henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Måling af bøjningsvinklen af ImageJ. (A) Se billedet J programmet ved at dobbeltklikke. (B) De store værktøjer, der blev brugt i målingen vinkel. (C) Åbn "File" option efterfulgt af sub-option "åbne" i billede J værktøjslinjen for at åbne mikroskopi billeder, der er gemt i JPEG-filformat. (D (F) Oversigt over måling vinkel: abc definerer en fast A, og den sande ombøjningsvinkel beregnes som B, som er lig med 180 ° - A. (G) Linie repræsenterer afstanden fra punkt A til punkt B. (H) kontinuitet linje ab at pege c making A. (I) Resultat fil for billede J viser En værdi. (J) Repræsentant regneark fil viser de gennemsnitlige bøjning vinkelmålinger, standard afvigelser, standard fejl og t-test beregninger. (K) Søjlediagram diagram viser de bøjende vinkelmålinger mellem to forskellige plante baggrunde Col-0 og dsGSL8 EMS mutant. Fejl barer er SEM (standard af middelværdien +) og *** repræsenterer betydningen af T-test (p-værdi> 0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Oversigt over de skridt, der er involveret i HPTS lastning analysen. (A) Panel viser fremstilling af HPTS agarose blokke. (B) Panelet repræsenterer udskæring og overførsel af kimplanter og lastningen af HPTS agarose blokke. (C) Panel viser de trin, der er involveret i prøveforberedelse til konfokal billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Måling af callose intensitet ved ImageJ. (A) Se ImageJ programmet ved at dobbeltklikke. (B) De store værktøjer, der blev brugt i callose intensitet måling. (C) Åbn "File" option efterfulgt af sub-option "åbne" i ImageJ værktøjslinjen for at åbne mikroskopi billeder, der er gemt i JPEG-filformat. (D) Den rektangulære ikon på ImageJ værktøjslinjen. (E) Det valgte område af billedet til at analysere callose intensitet. (F) ImageJ resultat fil viser callose intensiteten værdi som "Mean". (G)Repræsentant regneark fil viser de gennemsnitlige callose intensitet målinger, standardafvigelser, standard fejl og t-test beregninger. (H) Søjlediagram diagram repræsenterer callose intensitet forskellen mellem de to plante baggrunde. Fejl barer er SEM (standard af middelværdien +) og *** repræsenterer betydningen af T-test (p-værdi> 0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Reduktion af AtGSL8 udtryk fører til defekt Tropic svar. (A) fototropisk reaktion viste ved dsGSL8 (± dex) sammen med Col-0. (B) Gravitropic respons vist ved dsGSL8 (± dex) al ong med Col-0. dsGSL8 (+ dex) viser ingen fototropisk eller gravitropic svar. dsGSL8 (+ dex) og dsGSL8 (-dex) symboliserer dexamethason-behandlet og ubehandlet dsGSL8 inducerbare RNAi linjer, henholdsvis. Scale søjle repræsenterer 0,2 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. symplasmic bevægelse steg efter undertrykkelsen af AtGSL8. Fluorescens billeder blev taget efter HPTS lastning til dsGSL8 ± dex hypokotyle snitfladerne sammen med vildtype Col-0. DsGSL8 (+ dex) viste mere omfattende bevægelse af HPTS farvestof, hvilket viser øget symplasmic bevægelse. Scale bar repræsenterer 0,2 mm.dk / filer / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7. AtGSL8 undertrykte linjer viste symmetrisk PD callose fordeling mellem belyste og skyggefulde sider af hypokotyle. (A) Fluorescence billede, der viser anilin blå callose farvning for dsGSL8 (-dex) ved 0 timer. (B) Fluorescence billede, der viser anilin blå callose farvning for dsGSL8 (-dex) efter 6 timer af fototropisme. (C) Fluorescence billede, der viser anilin blå callose farvning for dsGSL8 (+ dex) efter 6 timer af fototropisme. Gule pile angiver callose ophobning på skyggefulde område af hypokotyle. Scale bar repræsenterer 50 um. (D) Søjlediagram diagram repræsenterer amount af PD callose der akkumuleret i dsGSL8 (± dex) kimstængler før og efter 3 timer og 6 timer af fototropisme. Fluorescens foci intensiteter blev målt fra ti uafhængige kimstængler (data er gennemsnit ± SD; t-test, * p <0,01). Dette tal har været ændret siden (Han et al., 2014) ^15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I dette manuskript, til en strategi screene mutant / over-udtryk linjer, der er defekte fototropisk og gravitropic reaktioner som følge af ændret PD callose og dermed er PD SEL beskrevet i detaljer. PD callose syntese og nedbrydning hovedsageligt opnås ved callose syntaser og β-1,3-glucanaser, men reguleringen af ​​disse enzymer er kontrolleret af mange opstrøms faktorer. For at søge efter sådanne opstrøms faktorer eller kandidater, der er direkte involveret i PD regulering, har vi oprettet denne metode til screening. Dette oprettet har nogle begrænsninger som mutanter af nogle vigtige enzymer, der regulerer PD callose biosyntese (gsl8) er dødelige ¹⁵ og til at sortere ud sådanne mutanter ville være begrænset af denne oprettet. Også, hvis kandidaten gen viser hurtigere eller langsommere tropic respons sammen med åben eller lukket PD, men det callose niveauet er uændret, så der er behov for detaljerede analyser for yderligere at karakterisere sådanne kandidater. De kritiske faktorer og fejlfinding proceSSES i hvert trin er også udarbejdet. Først, i medium forberedelse, en kritisk faktor, der kan påvirke plantevæksten er pH af de medier, der bør ligge mellem 5.7-5.8. For det andet, passende overflade tørring af agarplader er vigtig; det ville være vanskeligt at løfte de tre dage gamle kimplanter uden skader fra agarplader med højt vandindhold. for meget tørring af agarplader, kan imidlertid medføre, at nogle revner i medierne under inkubation og forårsage usymmetrisk kimplantevækst. Under overfladen sterilisering af frø ved anvendelse af natriumhypochloritopløsning, skal der drages omsorg for at fjerne natriumhypochlorit fuldstændigt ved gentagen vask med autoklaveret Hedeselskabet ₂ O, da det er en stærk blegemiddel. Autoklaveret Hedeselskabet ₂ O bør tilberedes frisk og håndteres aseptisk, som gamle lagre kan forårsage svampeangreb i MS-plader. Efter sterilisering er frø stratificeret efter kuldebehandling at synkronisere spiring. Denne proces kan udføres enten ved transferring steriliseret våde frø direkte til et koldt rum i mørke betingelser eller først dotting frøene på MS-plader og derefter overføre pladerne til et koldt rum i mørke omgivelser. Imidlertid foretrækker vi sidstnævnte, fordi det giver en mere ensartet vækst af frøplanter. Mens øremærkninger frø, bør afstanden mellem to tilstødende frø være på mindst 0,1 cm, fordi meget nøje punkteret frø ville resultere i vækst af overlappende kimplante, som er meget vanskelige at overføre i efterfølgende eksperimenter.

For ordentlig fototropisk og gravitropic reaktioner, bør kimplanter ikke udsættes for lys og bør forblive ubeskadiget. For at undgå baggrunden virkninger af hvidt lys, skal du vælge omhyggeligt de planter under en grøn lyskilde i mørke rum som planter ikke reagerer på grønt lys. Grøn lyskilde kan genereres ved at dække hvide lyskilde anvendelse af transparente grønne vinylark. Til valg af planter, en steriliseret tandstikker er den bedste løsning. Tryk the meget nederste del af kimstænglen med tandstikker til at løfte de planter, således at de let kan overføres til en ny plade. Alle de planter bør være ens i størrelse og krog orientering. Under vores eksperimenter, så vi, at hvis krogen retning er på den modsatte side af lyskilden, vil planterne viser en hurtigere tropic respons end planter med samme krog retning som lyskilde. Normalt i tilfælde af fototropisme, kan man se en klar forskel i bøjningsvinklen mellem sande kandidater og Col-0 indenfor 3 timer, mens der i tilfælde af gravitropism, det normalt tager 6-12 timer. Endelig, for at have statistisk relevante data, mindst tre biologiske replikater og 20 kimplanter er brug hver gang.

For at teste omfanget af symplasmic bevægelse mellem forskellige plantearter baggrunde, HPTS farvestof læsning er en bekvem teknik, da det ikke behøver avancerede værktøjer og instrumentering. På HPTS loading assay procentdelen af ​​gel i HPTS agarose blokke er af stor betydning, som en meget skør eller hård gel ikke vil give optimale resultater. Det er bedre at bruge en 50 ml konisk kolbe med løs gummi og ikke at anvende en stor volumen kolbe til kogende agarose med 10 ml vand. HPTS agarose blokke kan anvendes i en uge efter fremstillingen, hvis de opbevares omviklet med aluminiumfolie ved 4 ° C. En anden vigtig faktor i HPTS lastning analysen er excision af hypokotyle krogen region. Excision bør udføres med skarpe dissektion saks og på et tilsvarende position for alle planter. Excision med stumpe saks kan forårsage uønsket skade på kimplanter og kan hindre HPTS belastning. Derudover kan sætteplante vækstbetingelser og udviklingstrin de spiller en afgørende rolle i farvestof bevægelse, som callose ophobning er mere tilbøjelige til at reagere på sådanne ændringer, som endelig tegner sig for hindring i farvestoffet bevægelse. Således er det nødvendigt at dyrke planter under optimale forhold. Callose på PD spiller en central rolle itropic responser af etiolerede kimplanter ved at regulere PD SEL, hvilket er vigtigt for auxin gradient dannelse ^15. Callose niveauer kan detekteres ved farvning med anilin blå eller immunguld mærkning. Farvning med anilin blå er en enkel og hurtig fremgangsmåde til detektion af callose niveau. Fordi hypokotyleksplantater celler har høj turgortryk og en epi-kutikula lag, er det ikke let for farvestoffet at trænge ind i cellerne. Derfor har vi udviklet cut-farvning metode til at tillade anilin blå farvestof til at trænge let. Der er imidlertid en risiko for syntese af nye callose som kan påvirke farvningsresultaterne, hvilket er en begrænsning af den normale callose farvningsfremgangsmåde. For at undgå sådanne virkninger, er det farvningsprotokollen modificeret ved tilsætning af callose synthase inhibitor 2-D-deoxy glucose (DDG) til farvning buffer. Således er denne protokol involverer måling af allerede eksisterende callose kun i det nedre område af kimstænglen det er præcis under cut site. Undgå brug af frisk prepared anilin blå, og holde anilin blå opløsning ved stuetemperatur i mindst 48 timer før brug. Vi bemærkede, at farvning med frisk anilin blå løsning giver ikke optimale callose farvningsresultaterne.

Samlet set har vi præsenteret en række strategier, der kan anvendes til hurtig screening af mutanter / over-udtryk linjer med en defekt eller forbedret tropic svar ved at ændre PD SEL ved direkte eller indirekte at modulere PD callose. En tidligere faktum om Tropic svar var majorly begrænset til virkningen af auxin luftfartsselskaber, signalpaneler aktører, såsom PINIOD ^2-14. Derudover har vi også etableret en kritisk rolle symplasmic bevægelse af auxin i at opretholde en auxin-gradient i kimstænglen systemet ^15. Enkelheden og alsidigheden af ​​denne metode utvivlsomt styrke sin anvendelighed i efterforskningen kandidatgener for deres regulering af PD SEL og dermed spiller en afgørende rolle i plantens udvikling, herunder tropiske svar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds