Huidige ex vivo modellen van glioblastoom (GBM) zijn niet geoptimaliseerd voor fysiologisch relevant onderzoek naar menselijke tumorinval. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en onderhouden van organotypische plakculturen uit vers menselijk GBM-weefsel. Een beschrijving van time-lapse microscopie en kwantitatieve cel migratie analyse technieken wordt verschaft.
Glioblastoom (GBM) heeft ondanks chirurgische, chemotherapeutische en radiotherapie een extreem slechte klinische prognose. Progressieve tumorinval in het omliggende hersenparenchyma vertegenwoordigt een blijvende therapeutische uitdaging. Om anti-migratie therapieën voor GBM te ontwikkelen, zijn model systemen die een fysiologisch relevante achtergrond voor gecontroleerde experimenten verschaffen essentieel. Hier presenteren wij een protocol voor het genereren van plakculturen uit menselijk GBM-weefsel dat wordt verkregen tijdens chirurgische resectie. Deze culturen maken het mogelijk ex-vivo experimentatie zonder passeren door dierlijke xenografen of enkelcelculturen. Verder beschrijven we het gebruik van confocal microscopie met behulp van time-lapse laser scanning in combinatie met cell tracking om het migrerende gedrag van tumorcellen kwantitatief te bestuderen en de daarmee verband houdende respons op de therapeutica. Plakjes worden reproduceerbaar gegenereerd binnen 90 minuten van chirurgische weefselverwerving. Retrovirale gemedieerde fluorescerende cel laBeling, confocal imaging en tumor cell migratie analyses worden vervolgens binnen twee weken na de kultuur voltooid. We hebben deze slice culturen succesvol gebruikt om genetische factoren die verband houden met verhoogd migrerend gedrag in menselijke GBM te ontdekken. Verder hebben we het vermogen van de patiënt geconstateerd om patiëntenspecifieke variatie te detecteren in reactie op anti-migratie therapieën. Doorgaan naar voren zijn menselijke GBM-segmentculturen een aantrekkelijk platform voor snelle ex vivo beoordeling van tumorgevoeligheid voor therapeutische middelen, om gepersonaliseerde neuro-oncologische therapie te bevorderen.
De laboratoriumstudie van glioblastoom (GBM) wordt belemmerd door een gebrek aan modellen die de vereiste pathologische kenmerken van de menselijke ziekte getrouwd herhalen, namelijk tumorcel migratie en invasie. Vergelijkende studies van 2D- en 3D- in vitro- assays, evenals 3D-knaagdier-slice-cultuurmodellen, hebben mechanistische uiteenlopende cellulaire migratieprogramma's in deze twee contexten ontdekt, waardoor de translatabiliteit van bevindingen van 2D-systemen mogelijk is voor de menselijke ziekte 1 , 2 , 3 . De hier beschreven organotypische tumorskijfcultuur en imagingparadigma maakt het mogelijk om tumorcel migratie te onderzoeken in segmenten ex vivo humaan tumorweefsel verkregen uit chirurgische resectie. Zo vormen slice culturen van chirurgisch geresecteerd tumorweefsel in samenhang met confiscale microscopie met time-lapse een platform om tumorcelmigratie in de native te bestuderenMicro-omgeving zonder weefseloplossing of cultuurpassage.
Er is uitgebreide literatuur die gebruik maakt van knaagdierbrein-slice cultuurmodellen van GBM gegenereerd uit humane tumor xenografen, retrovirale geïnduceerde tumoren en cellulaire overlays om tumorinval 1 , 2 , 3 , 4 , 5 te bestuderen. Onlangs hebben verschillende groepen de generatie van organotypische snijculturen beschreven direct van humaan GBM-weefsel 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Er is echter een duidelijke variatie tussen gepubliceerde protocollen met betrekking tot snijtechniek en cultuurmedia. Verder heeft het gebruik van organotypische snijculturen zich geconcentreerd op statische experimentele eindpunten die veranderingen in celsignaal hebben opgenomenNg, proliferatie en dood. Het hierin beschreven protocol breidt zich uit op vroegere scherpcultuurparadigma's door tijdopgenomen observatie van dynamische tumorcelgedrag in te nemen door middel van time-lapse laser scanning confocal microscopy. Recente ontdekking van inter 11 en intratumorale 12 , 13 genetische variatie in humane GBM onderstreept het belang van het verbinden van deze heterogeniteit met tumorcelgedrag en de implicaties ervan op tumorrespons op therapie. Hier rapporteren we een gestroomlijnd en reproduceerbaar protocol voor het gebruik van directe snijculturen uit een menselijk kankerweefsel om tumorcelmigratie in nabije real-time te visualiseren.
Organotypische snijculturen uit menselijk kankerweefsel bieden een aantrekkelijk en onderbenut platform voor preklinische translatie-experimenten. Het ontbreken van een begrip van populair gedrag van tumorcellen met betrekking tot migratie, proliferatie en celdood in de micro-omgeving van de moedertaal. Critisch kan het bestuderen van tumorrespons op therapie in een dynamische, tijdopgeloste manier op het niveau van celgedrag licht werpen op nieuwe mechanismen van behandelingsweerstand. Human tumor slice culturen versch…
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Dr. Lee Niswander en dr. Rada Massarwa bedanken voor hun technische expertise en bijdragen aan het hier beschreven sneeuwcultuur-confocale beeldvormingsprotocol. Verder dankzij dr. Kalen Dionne die deskundigheid verstrekt over het optimaliseren van hersen tumorweefsel snijden en kweekparameters.
DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
Equipment | |||
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |