A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות
Summary
מודלים vivo לשעבר של גליובלסטומה (GBM) אינם מותאמים למחקר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של הפלישה של הגידול האנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ותחזוקה של תרבויות פרוסה organotypic מרקמת GBM אדם טרי. תיאור של זמן לשגות מיקרוסקופיה ו כמותי תא הגירה טכניקות ניתוח מסופק.
Abstract
Glioblastoma (GBM) ממשיך לשאת פרוגנוזה קלינית ירודה ביותר למרות טיפול כירורגי, כימותרפי, והקרנות. הפלישה המתקדמת של הגידול לתוך פרנכימה במוח מייצגת אתגר טיפולי מתמשך. כדי לפתח טיפולים נגד הגירה עבור GBM, מערכות מודל המספקים רקע רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לניסוי מבוקר חיוניים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרבויות פרוסה מרקמת GBM האדם שהושג במהלך כריתה כירורגית. תרבויות אלה מאפשרים ניסויים vivo לשעבר ללא passaging דרך xenografts בעלי חיים או תרבויות תא בודד. יתר על כן, אנו מתארים את השימוש של זמן לשגות לייזר סריקה מיקרוסקופיה confocal בשיתוף עם מעקב תא כדי ללמוד באופן כמותי את ההתנהגות הנדידה של תאים סרטניים התגובה הקשורים לתרפוי. פרוסות הם reproducibly שנוצר בתוך 90 דקות של רכישת רקמות כירורגיות. Retrovirally בתיווך תא פלואורסצנטי להBeling, הדמיה confocal, ותאי הגירה הגידול התא הם השלימו לאחר מכן בתוך שבועיים של תרבות. השתמשנו בהצלחה אלה תרבויות פרוסה לחשוף גורמים גנטיים הקשורים הגדילה את התנהגות הנדידה GBM האדם. יתר על כן, יש לנו אימות של היכולת של המודל לזהות וריאציה ספציפית למטופל בתגובה טיפולים נגד הגירה. לנוע קדימה, תרבויות פרוסות GBM האדם הם פלטפורמה אטרקטיבית להערכה מהירה vivo מהיר של רגישות הגידול לסוכנים טיפוליים, על מנת לקדם טיפול נוירו אונקולוגי אישית.
Introduction
מחקר המעבדה של glioblastoma (GBM), הוא הפריע על ידי חוסר מודלים כי בנאמנות לסכם את המאפיינים הפתולוגיים הנדרשים של המחלה האנושית, כלומר גידול תאים וגידול הפלישה. מחקרים השוואתיים של 2D ו -3 D במבחני הפלישה חוץ גופית, כמו גם מודלים 3D מכרסמים תרבות פרוסה חשפו מכנית שונה תוכניות העברה הסלולר בשני הקשרים אלה, פוטנציאל הגבלת translatability של ממצאים ממערכות 2D למחלה אנושית 1 , 2 , 3 . התרבות organotypic פרוסה התרבות פרדיגמה הדמיה שתוארו כאן מאפשר המחקר של הגירה תא הגידול בתוך פרוסות של רקמה vivo הגידול האנושי לשעבר המתקבל כריתה כירורגית. לפיכך, פרוסות תרבויות של רקמת הגידול רקד כיתוב יחד עם מיקרוסקופיה פרוטוקול זמן לשגות לספק פלטפורמה ללמוד הגירה תא הגידול ילידMicroenvironment ללא פירוק רקמות או תרבות passaging.
יש ספרות מקיפה המעסיקים מכרסמים המוח מודלים התרבות פרוסה של GBM שנוצר xenografts הגידול האנושי, גידולים המושרה רטרובירל, ואת שכבות הסלולר ללמוד הפלישה הגידול 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . לאחרונה, כמה קבוצות תיארו את הדור של תרבויות פרוסה organotypic ישירות מ GBM רקמות האדם 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . עם זאת, יש וריאציה ניכרת בין הפרוטוקולים שפורסמו לגבי חיתוך טכניקה תרבות התקשורת. יתר על כן, השימוש בתרבויות פרוסה organotypic התמקדה endpoints סטטי סטטי שכלל שינויים Cell signaliNg, התפשטות, ומוות. הפרוטוקול המתואר כאן מרחיב על פרדיגמות תרבות פרוסה קודם על ידי שילוב תצפית נפתרה זמן של התאים תאים סרטניים דינמיים באמצעות מיקרוסקופיית זמן לסרוק מיקרוסקופיה confocal. גילוי אחרון של 11 בין 11 ו intratumoral 12 , 13 וריאציה גנטית האדם GBM מדגיש את החשיבות של קישור הטרוגניות זו עם התאים התא הגידול והשלכותיה על התגובה הגידול לטיפול. כאן, אנו מדווחים פרוטוקול יעיל לשחזור לשימוש של תרבויות פרוסה ישירה מרקמת סרטן האדם לדמיין הגירה תא הגידול כמעט בזמן אמת.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרבויות פרוסה Organotypic מרקמת סרטן האדם לספק פלטפורמה אטרקטיבית underutilized עבור ניסויים טרנסציוניים pre-Clinical. ההבנה של התנהגויות ברמת האוכלוסייה של תאים סרטניים לגבי הגירה, התפשטות, ומוות של תאים microenvironment הגידול המקומי הוא חסר. באופן ביקורתי, לימוד תגובת הגידול לטיפול באופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ד"ר לי Niswander וד"ר ראדה Massarwa על המומחיות הטכנית שלהם תרומות לפרוסה פרוטוקול confocal הדמיה פרוטוקול המתואר כאן. תודה רבה לד"ר קאלן Dionne שסיפק מומחיות לגבי אופטימיזציה של המוח חיתוך רקמת הגידול ופרמטרים תרבות.
Materials
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
References
- Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
- Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
- Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
- Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
- Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
- Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
- Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
- Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
- Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
- Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
- Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
- Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
- Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
- Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).
