종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과
Summary
glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다.
Abstract
Glioblastoma (GBM)는 수술, 화학 요법 및 방사선 요법에도 불구하고 극도로 열악한 임상 예후를 계속 수행합니다. 주변 뇌 실질로 진행성 종양 침입은 지속적인 치료 도전을 나타냅니다. GBM에 대한 안티 – 마이 그 레이션 요법을 개발하기 위해서는 통제 된 실험을 위해 생리적으로 관련된 배경을 제공하는 모델 시스템이 필수적입니다. 여기, 우리는 수술 절제술 동안 얻은 인간의 GBM 조직에서 조각 문화를 생성하기위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 배양 물은 동물 이종 이식 물 또는 단일 세포 배양 물을 통과하지 않고 생체 외 실험을 허용한다. 또한, 종양 세포의 이동성 및 치료제에 대한 관련 반응을 정량적으로 연구하기 위해 세포 추적과 함께 시간 경과 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 설명합니다. 절편은 수술 조직 획득 90 분 이내에 재현 가능하게 생성됩니다. Retrovirally 중재 형광 세포 라beling, 공 촛점 이미징 및 종양 세포 이동 분석은 문화의 2 주 이내에 완료됩니다. 우리는 인간 GBM에서 증가 된 철새 행동과 관련된 유전 적 요인을 밝히기 위해 이러한 조각 문화를 성공적으로 사용했습니다. 또한, 우리는 안티 – 마이 그 레이션 요법에 대한 응답으로 환자 – 특정 변형을 감지하는 모델의 능력을 검증했다. 앞으로 인간 GBM 슬라이스 문화는 개인화 된 신경 종양 치료법을 발전시키기 위해 치료제에 대한 종양 감수성을 빠른 생체 내 평가를위한 매력적인 플랫폼입니다.
Introduction
glioblastoma (GBM)에 대한 실험실 연구는 종양 세포의 이동과 침입과 같은 인간 질병의 필수 병리학 적 특징을 충실히 재구성하는 모델의 부족으로 인해 방해 받고 있습니다. 2 차원 및 3 차원 체외 침윤 분석 및 3D 설치류 슬라이스 배양 모델의 비교 연구는이 두 상황에서 기계적으로 다른 세포 이동 프로그램을 발견하여 2D 시스템에서 인간 질병 1 , 2 , 3으로 의 결과의 번역 가능성을 잠재적으로 제한합니다. 여기에 설명 organotypic 종양 슬라이스 문화 및 이미지 패러다임은 수술 절제에서 얻은 전직 인간의 종양 조직의 조각 내에서 종양 세포 마이 그 레이션의 연구 수 있습니다. 따라서, 시간 경과 공 촛점 현미경과 함께 외과 절제 종양 조직의 슬라이스 문화는 기본에서 종양 세포 이동을 연구하는 플랫폼을 제공합니다조직 용해 또는 배양 passaging없이 microenvironment.
인간 종양 이종 이식, 레트로 바이러스 유발 종양 및 세포 오버레이에서 생성 된 GBM의 설치류 뇌 절편 배양 모델을 사용하여 종양 침습 1 , 2 , 3 , 4 , 5 를 연구하는 광범위한 문헌이있다. 최근에 여러 그룹이 인간 GBM 조직 6 , 7 , 8 , 9 , 10 에서 직접 organotypic 슬라이스 문화의 세대를 설명했다. 그러나, 기술 및 배양 배지를 슬라이싱하는 것과 관련하여 공개 된 프로토콜 간에는 현저한 차이가있다. 더 나아가, organotypic 슬라이스 문화의 사용은 세포 signali의 변화를 포함 정적 실험 종점에 초점을 맞추고있다신장, 증식 및 사망을 초래할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 시간 경과 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경을 통해 동적 종양 세포 행동의 시간 분해 관찰을 통합하여 이전의 슬라이스 문화 패러다임을 확대합니다. 인간 GBM에서의 inter 11 및 intratumoral 12 , 13 유전 변이의 최근 발견은 종양 세포 거동과이 이질성을 연결시키는 중요성과 치료에 대한 종양 반응에 미치는 영향을 강조한다. 여기에 우리는 거의 실시간으로 종양 세포 이동을 시각화하기 위해 인간 암 조직에서 직접 슬라이스 문화의 사용에 대한 간소하고 재현 가능한 프로토콜을보고합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 암 조직에서 유래 한 organotypic slice culture는 전임상 번역 실험을위한 매력적이고 활용도가 낮은 플랫폼을 제공합니다. 토종 미세 환경에서 이동, 증식 및 세포 사멸과 관련하여 종양 세포의 인구 수준 행동을 이해하는 것은 부족합니다. 비판적으로, 세포 행동의 수준에서 역동적이고 시간 – 해결 방식으로 치료에 종양 반응을 연구 치료 저항의 새로운 메커니즘에 빛을 발산 수 있습니다. 인?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lee Niswander 박사와 Rada Massarwa 박사에게 기술 전문 지식과 여기에 설명 된 슬라이스 문화 공 촛점 이미징 프로토콜에 대한 공헌에 감사드립니다. 뇌 종양 조직 슬라이싱 및 배양 변수 최적화에 관한 전문 지식을 제공 한 Kalen Dionne 박사에게 감사드립니다.
Materials
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
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