L'induzione di uno Stato Isoelectric cervello per studiare l'impatto di endogeno Synaptic attività su NEURONALE<em> In Vivo</em
Summary
Questa procedura esegue di lunga durata in vivo registrazioni intracellulari da singoli neuroni durante fisiologicamente rilevanti stati cerebrali e dopo la completa abolizione delle attività elettriche in corso, con un conseguente stato cerebrale isoelettrico. Le costanti fisiologiche dell'animale sono attentamente monitorati durante il passaggio alla condizione di coma artificiale.
Abstract
Le informazioni di processo neuroni modo dipende sia loro proprietà intrinseche di membrana e sulla dinamica della rete sinaptica afferente. In particolare, l'attività di rete endogenamente generata, che varia fortemente in funzione dello stato di vigilanza, modula significativamente neuronale calcolo. Per studiare come diverse dinamiche cerebrali spontanei impatto proprietà integrative singoli neuroni ', abbiamo sviluppato una nuova strategia sperimentale nel ratto che consiste nel sopprimere in vivo tutta l'attività cerebrale mediante una iniezione sistemica di una dose elevata di sodio pentobarbital. attività corticale, continuamente monitorate da electrocorticogram combinato (ECoG) e le registrazioni intracellulari vengono progressivamente rallentate, portando ad un profilo isoelettrico costante. Questa estrema stato cerebrale, mettendo il topo in un coma profondo, è stata attentamente monitorata misurando le costanti fisiologiche dell'animale durante gli esperimenti. R intracellulareecordings permesso di caratterizzare e confrontare le proprietà integrative delle stesse neurone incorporato in dinamiche corticali fisiologicamente rilevanti, come quelle incontrate nel ciclo sonno-veglia, e quando il cervello era completamente silenzioso.
Introduction
In assenza di stimoli ambientali o attività comportamentali, il "riposo" cervello genera un flusso continuo di attività elettrica che può essere registrato dal cuoio capelluto, come elettroencefalografiche onde (EEG). Il correlato intracellulare di questa attività cerebrale endogena è caratterizzato da fluttuazioni di tensione sfondo membrana (noto anche come "rumore sinaptica"), che sono composti da una combinazione di potenziali sinaptici eccitatori e inibitori che riflettono l'attività in corso delle reti afferenti 1,2. Questa attività spontanea varia in frequenza e ampiezza con i diversi stati di vigilanza. Chiarire l'impatto delle attività di rete su l'eccitabilità e la reattività dei singoli neuroni è una delle maggiori sfide delle neuroscienze 3,4.
Molti studi sperimentali e computazionali hanno esplorato l'impatto funzionale di attività sinaptica in corso sulla Proprieta integrativos di neuroni. Tuttavia, il ruolo dei diversi parametri neuronali influenzato dal rumore di fondo sinaptica resta sfuggente. Per esempio, il livello medio di depolarizzazione della membrana è stato trovato positivamente o negativamente 5,6 7-9 correlata con la capacità di input sensoriali per innescare potenziali d'azione. Inoltre, mentre alcune indagini suggeriscono che le fluttuazioni del potenziale di membrana, risultanti da un flusso continuo variabile di ingressi sinaptici afferenti, influenzano pesantemente la capacità di risposta dei singoli neuroni modulando il guadagno del loro rapporto input-output 3,10-13, altri indicano che variazioni di conduttanza di entrata membrana mediate dalla manovra di inibizione sono sufficienti per modulare il guadagno neuronale indipendentemente dalla grandezza delle fluttuazioni di membrana 14,15. Infine, recenti studi condotti su animali svegli hanno sottolineato come l'elaborazione delle informazioni sensoriali in singolo neurone dipende in modo critico sulla stato di vigilanza unND l'attuale domanda comportamentale 16,17.
Una strategia semplice per chiarire il ruolo funzionale di un determinato processo in un sistema altamente interconnesso è determinare come sua assenza altera specificatamente il funzionamento del sistema. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato nella ricerca neuroscienze, ad esempio utilizzando lesioni sperimentali o inattivazione di diverse aree cerebrali 18-21, o blocco farmacologico di specifici canali ionici 22,23. In particolare, è stato applicato in vivo per svelare come le dinamiche di connettività di rete e funzionali influenzano il calcolo singola cellula 24-27. Tuttavia, ad oggi manipolazioni locali destinati a bloccare la cottura dei neuroni e / o turbare le loro proprietà biofisiche di base può essere parzialmente efficaci e sono limitati a relativamente piccoli volumi cerebrali 28.
Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato un nuovo approccio sperimentale in vivo inil ratto per confrontare le proprietà elettrofisiologiche dei singoli neuroni registrati in un determinato stato cerebrale, cioè, incorporati in una particolare rete dinamico, a quelli ottenuti dopo la completa soppressione del tutto il cervello attività sinaptica 29. In condizioni di controllo, due dinamiche corticali distinti possono essere generati. electrocorticographic (ECOG) sonno-like sono stati indotti da iniezione di dosi moderate di sodio pentobarbital. In alternativa, veloci onde ECOG di piccola ampiezza paragonabile alla attività corticale alla base della stato di veglia (veglia-come il modello) potrebbero essere prodotti mediante iniezione di fentanil. Successivamente, mantenendo la stessa ECoG e la registrazione intracellulare, un silenziamento completa dell'attività elettrica cerebrale endogena è stata ottenuta per iniezione sistemica di una dose elevata di sodio pentobarbital, caratterizzato da ECoG isoelettrico e attività intracellulari. Perché l'induzione di un coma così estremo potrebbe potenzialmente avere conseguen fataleces sulle funzioni biologiche, un attento e continuo monitoraggio delle variabili fisiologiche era essenziale. Pertanto, abbiamo meticolosamente seguito la frequenza del battito cardiaco, la fine espirazione concentrazione di CO 2 (EtCO 2), la saturazione O 2 (SpO 2) e la temperatura corporea del ratto durante gli esperimenti.
Valutiamo neuroni singoli proprietà nel corso di questi diversi stati utilizzando microelettrodi taglienti, che sono particolarmente adatti per lunghe e stabili le registrazioni in vivo. Il procedimento qui descritto, può essere combinato con altri approcci elettrofisiologiche e di imaging e potrebbe essere estesa ad altri modelli animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui un nuovo metodo per sopprimere in vivo l'attività elettrica cerebrale spontanea, sia a rete e livello cellulare. Questa procedura porta ad un estremo stato del cervello, nota come comatoso isoelettrico 41. Da un punto di vista clinico, un tale inattività electrocerebral è l'anomalia più grave che può essere visto sul EEG. Si tratta per lo associato ad un coma irreversibile, con tutti i pazienti o morire o continuare in uno stato vegetativo persistente 42, ma pu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla Fondation de France, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l'Università Pierre e Marie Curie e il programma 'Investissements d'avenir' ANR-10-IAIHU-06.
Materials
| Sodium Pentobarbital | Centravet | Pentobarbital | |
| Ketamine 500 | Merial | Imalgène 500 | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag | Fentanyl | |
| Xylocaine | Centravet | Xylovet | |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134 | |
| ECoG amplifier | A-M Systems | AC amplifier, Model 1700 | |
| Intracellular amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | |
| Data acquisition interface | Cambridge Electronic Design | CED power 1401-3 | |
| Data analysis software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 7 | |
| micromanipulator | Scientifica | IVM-3000 | |
| Capillary Puller | Narishige | PE-2 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-10 | |
| Silver wire 0.125mm (intracellular recording) | WPI | AGT0525 | |
| Ag-AgCl reference | Phymep | E242 | |
| Silver wire 0.25mm (ECoG recording) | WPI | AGT1025 | |
| Artificial respiration system | Minerve | Alpha Lab | |
| Physiological parameters monitoring | Digicare | LifeWindow Lite | |
| Heating Blanket | Harvard Apparatus | 507215 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Scissors | FST | 15005-08 | |
| Forceps Dumont #5 | FST | 11295-10 | |
| Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-00 | |
| IP Polyurethane catheter – 0.43×0.69mm | Instech | BTPU-027 | |
| Silicon elastomere | WPI | KWIK-CAST | |
| Dental drill | NSK | Y1001151 and P496 | |
| Surgical glue | 3M | vetbond |
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