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Articolo metodologico

L'induzione di uno Stato Isoelectric cervello per studiare l'impatto di endogeno Synaptic attività su NEURONALE

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DOI:

10.3791/53576

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31 marzo 2016

 ,  ,  ,  , 
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

In questo articolo

Sommario

Questa procedura esegue di lunga durata in vivo registrazioni intracellulari da singoli neuroni durante fisiologicamente rilevanti stati cerebrali e dopo la completa abolizione delle attività elettriche in corso, con un conseguente stato cerebrale isoelettrico. Le costanti fisiologiche dell'animale sono attentamente monitorati durante il passaggio alla condizione di coma artificiale.

Abstract

Le informazioni di processo neuroni modo dipende sia loro proprietà intrinseche di membrana e sulla dinamica della rete sinaptica afferente. In particolare, l'attività di rete endogenamente generata, che varia fortemente in funzione dello stato di vigilanza, modula significativamente neuronale calcolo. Per studiare come diverse dinamiche cerebrali spontanei impatto proprietà integrative singoli neuroni ', abbiamo sviluppato una nuova strategia sperimentale nel ratto che consiste nel sopprimere in vivo tutta l'attività cerebrale mediante una iniezione sistemica di una dose elevata di sodio pentobarbital. attività corticale, continuamente monitorate da electrocorticogram combinato (ECoG) e le registrazioni intracellulari vengono progressivamente rallentate, portando ad un profilo isoelettrico costante. Questa estrema stato cerebrale, mettendo il topo in un coma profondo, è stata attentamente monitorata misurando le costanti fisiologiche dell'animale durante gli esperimenti. R intracellulareecordings permesso di caratterizzare e confrontare le proprietà integrative delle stesse neurone incorporato in dinamiche corticali fisiologicamente rilevanti, come quelle incontrate nel ciclo sonno-veglia, e quando il cervello era completamente silenzioso.

Introduzione

In assenza di stimoli ambientali o attività comportamentali, il "riposo" cervello genera un flusso continuo di attività elettrica che può essere registrato dal cuoio capelluto, come elettroencefalografiche onde (EEG). Il correlato intracellulare di questa attività cerebrale endogena è caratterizzato da fluttuazioni di tensione sfondo membrana (noto anche come "rumore sinaptica"), che sono composti da una combinazione di potenziali sinaptici eccitatori e inibitori che riflettono l'attività in corso delle reti afferenti 1,2. Questa attività spontanea varia in frequenza e ampiezza con i diversi stati di vigilanza. Chiarire l'impatto delle attività di rete su l'eccitabilità e la reattività dei singoli neuroni è una delle maggiori sfide delle neuroscienze 3,4.

Molti studi sperimentali e computazionali hanno esplorato l'impatto funzionale di attività sinaptica in corso sulla Proprieta integrativos di neuroni. Tuttavia, il ruolo dei diversi parametri neuronali influenzato dal rumore di fondo sinaptica resta sfuggente. Per esempio, il livello medio di depolarizzazione della membrana è stato trovato positivamente o negativamente 5,6 7-9 correlata con la capacità di input sensoriali per innescare potenziali d'azione. Inoltre, mentre alcune indagini suggeriscono che le fluttuazioni del potenziale di membrana, risultanti da un flusso continuo variabile di ingressi sinaptici afferenti, influenzano pesantemente la capacità di risposta dei singoli neuroni modulando il guadagno del loro rapporto input-output 3,10-13, altri indicano che variazioni di conduttanza di entrata membrana mediate dalla manovra di inibizione sono sufficienti per modulare il guadagno neuronale indipendentemente dalla grandezza delle fluttuazioni di membrana 14,15. Infine, recenti studi condotti su animali svegli hanno sottolineato come l'elaborazione delle informazioni sensoriali in singolo neurone dipende in modo critico sulla stato di vigilanza unND l'attuale domanda comportamentale 16,17.

Una strategia semplice per chiarire il ruolo funzionale di un determinato processo in un sistema altamente interconnesso è determinare come sua assenza altera specificatamente il funzionamento del sistema. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato nella ricerca neuroscienze, ad esempio utilizzando lesioni sperimentali o inattivazione di diverse aree cerebrali 18-21, o blocco farmacologico di specifici canali ionici 22,23. In particolare, è stato applicato in vivo per svelare come le dinamiche di connettività di rete e funzionali influenzano il calcolo singola cellula 24-27. Tuttavia, ad oggi manipolazioni locali destinati a bloccare la cottura dei neuroni e / o turbare le loro proprietà biofisiche di base può essere parzialmente efficaci e sono limitati a relativamente piccoli volumi cerebrali 28.

Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato un nuovo approccio sperimentale in vivo inil ratto per confrontare le proprietà elettrofisiologiche dei singoli neuroni registrati in un determinato stato cerebrale, cioè, incorporati in una particolare rete dinamico, a quelli ottenuti dopo la completa soppressione del tutto il cervello attività sinaptica 29. In condizioni di controllo, due dinamiche corticali distinti possono essere generati. electrocorticographic (ECOG) sonno-like sono stati indotti da iniezione di dosi moderate di sodio pentobarbital. In alternativa, veloci onde ECOG di piccola ampiezza paragonabile alla attività corticale alla base della stato di veglia (veglia-come il modello) potrebbero essere prodotti mediante iniezione di fentanil. Successivamente, mantenendo la stessa ECoG e la registrazione intracellulare, un silenziamento completa dell'attività elettrica cerebrale endogena è stata ottenuta per iniezione sistemica di una dose elevata di sodio pentobarbital, caratterizzato da ECoG isoelettrico e attività intracellulari. Perché l'induzione di un coma così estremo potrebbe potenzialmente avere conseguen fataleces sulle funzioni biologiche, un attento e continuo monitoraggio delle variabili fisiologiche era essenziale. Pertanto, abbiamo meticolosamente seguito la frequenza del battito cardiaco, la fine espirazione concentrazione di CO 2 (EtCO 2), la saturazione O 2 (SpO 2) e la temperatura corporea del ratto durante gli esperimenti.

Valutiamo neuroni singoli proprietà nel corso di questi diversi stati utilizzando microelettrodi taglienti, che sono particolarmente adatti per lunghe e stabili le registrazioni in vivo. Il procedimento qui descritto, può essere combinato con altri approcci elettrofisiologiche e di imaging e potrebbe essere estesa ad altri modelli animali.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida dell'Unione Europea (direttiva 2010/63 / UE) e approvato dal Comitato Etico Charles Darwin sulla sperimentazione animale. Descriviamo qui la procedura che abbiamo abitualmente uso nel nostro laboratorio, tuttavia la maggior parte passi possono essere adattati per soddisfare le esigenze specifiche di ognuno.

1. Preparazione chirurgica

Nota: Tutti i punti di incisione e di pressione devono essere ripetutamente infiltrati con anestetico locale (lidocaina o bupivacaina). La presente procedura è terminale, se è necessaria una preparazione asettica diverse modifiche dovrebbero essere attuate.

  1. Anestetizzare un topo con pentobarbital sodico (40 mg / kg) e ketamina (50 mg / kg) in due iniezioni intraperitoneali separate localmente (IP).
  2. Lasciate che l'animale andare in anestesia generale e ripetutamente verificare che un aereo chirurgico di anestesia è raggiunto (nessuna reazione ai piedi pizzicare). Posizionare il ratto su una feedback termocoperta e inserire una sonda rettale per mantenere la temperatura interna intorno ai 37 ° C.
  3. Inserire un catetere nella cavità peritoneale per facilitare la successiva iniezione di anestetici ed evitare perforazione organi da punture d'ago ripetute 30.
    1. Agganciare i capelli sopra un piccolo (~ 2 - 3 mm) zona superiore una regione situata all'interno quadrante inferiore destro o sinistro dello stomaco.
      Nota: crema depilatoria può anche essere usato.
    2. Fare un 2 - mm incisione 3 sulla pelle con forbici affilate o un bisturi. Utilizzando smussa, rimuovere gli strati di grasso e muscoli fino a quando si osserva la cavità peritoneale.
    3. Inserire circa 1 - 2 cm di un piccolo catetere nella cavità e chiudere la ferita con colla chirurgica.
      (Es., 2 Francese - corrispondente a 0,043 mm diametro interno): Nota Il diametro e la lunghezza totale del catetere deve essere minimo per ridurre volumi morti. tubi in poliuretano sono più adatti.
    4. Fare un ciclo e di sutura tegli catetere alla pelle per fissarlo in posizione.
  4. Installare un tubo tracheale per controllare la ventilazione durante la respirazione artificiale.
    1. Per quanto riguarda il passaggio precedente, preparare l'area di interesse (1 - 2 cm sopra la trachea proprio sopra il manubrio), rimuovere il pelo e incidere la pelle.
    2. Blunt sezionare i primi strati di grasso e muscoli, quindi spostare la ghiandola salivare da parte e esporre la trachea sezionando delicatamente l'ultimo strato di muscoli.
    3. Rimuovere con attenzione i tessuti sopra la trachea e far scorrere un filo di sotto di essa con piccole pinze. Fare nodo di un chirurgo con il filo, ma non abbiamo ancora stretto esso.
    4. Incidere la trasversalmente trachea tra due anelli cartilaginei. sangue tampone nella trachea se presente.
    5. Inserire un tubo tracheale con diametro appropriato e serrare il nodo del filo per fissare il tubo stabile. Per aumentare la stabilità del filo può inoltre essere fissato in un punto del tubo endotracheale superiore.
    6. Suture la ferita vicino o utilizzare punti chirurgici. Evitare colla chirurgica qui se il tubo tracheale è destinato ad essere riutilizzato.
  5. Installare l'animale in un telaio stereotassico e monitorare attentamente le seguenti variabili fisiologiche: ECOG, SpO2, ETCO 2, frequenza cardiaca (tramite un elettrocardiogramma, ECG) e la temperatura interna. Monitorare e regolare queste variabili per mantenere una corretta profondità dell'anestesia e stato fisiologico. In particolare, integrare anestesia con una piccola dose (10 mg / kg) di pentobarbital sodico, se necessario.
  6. Applicare una pomata occhio su entrambi gli occhi per evitare la disidratazione. Agganciare i capelli sul cuoio capelluto, fare una incisione longitudinale (circa 2 cm) e resecare i tessuti connettivi sovrastanti il ​​cranio con un bisturi o una curette.
  7. Fai un piccolo (~ 1,5 mm di diametro) craniotomia sulla regione di interesse con un trapano dentistico.
    Nota: Qui, il campo barilotto della corteccia somatosensoriale primaria è mirato (7 - 8 mm anteriormente alla linea interaurale, 4,5- 5,5 mm lateralmente alla linea mediana 31). Risciacquare ripetutamente per dissipare il calore.
  8. Utilizzare pinze più belle per fare delicatamente un piccolo foro nella dura. Prenotare una regione ~ 0,5 millimetri all'interno della trapanazione cranica per posizionare l'elettrodo ECoG (vedi punto successivo). Permanentemente mantenere la corteccia umida con una soluzione di NaCl allo 0,9% (o fluido cerebro-spinale artificiale).
  9. Posizionare una bassa impedenza (~ 60 kΩ) elettrodo d'argento (l'elettrodo ECoG) sulla dura, evitando la regione corticale non coperta dalle meningi, e posizionare l'elettrodo di riferimento su un muscolo cuoio sull'altro lato della testa.
  10. In questa fase (30 min dopo l'iniezione di pentobarbital sodico ultima), mantenere l'anestesia ripetute iniezioni di sodio pentobarbital (10-15 mg / kg / h) o fentanyl (3-6 mg / kg / h) attraverso il catetere IP. Il primo si tradurrà in un lento oscillatorio, simile al sonno, modello ECoG mentre il secondo si tradurrà in un desincronizzato, veglia-like, profilo corticale.
  11. Regolare il v artificialeSistema entilation modo che la frequenza respiratoria e il volume sono simili a quelli della respirazione spontanea del ratto (range Normale 70 - 115 respiro / min 32). Quindi, collegare la ventilazione meccanica al tubo tracheale e verificare il corretto gonfiaggio della gabbia toracica (su entrambi i lati). In caso contrario, regolare la posizione del tubo di ventilazione nell'asse tracheale. Se necessario, aspirare la secrezione presente nella trachea con un catetere collegato ad una siringa o una pompa a vuoto.
  12. Se tutte le variabili fisiologiche 32-35 e ECoG 29,36 modelli riflettono un aereo chirurgico di anestesia stabile, fanno un'iniezione intramuscolare di gallamina in ogni gamba per paralizzare il ratto, 40 mg / kg per la prima iniezione e poi 20 mg / kg , ogni 2 ore 19,29,36,50.

2. registrazioni intracellulari

  1. Tirare una micropipetta di vetro (tagliente microelettrodo) con una ~ 0,2 micron punta come la sua resistenza varia between 50 e 80 MW, una volta riempiti di 2 M acetato di potassio (KAC).
  2. Posizionare la pipetta in un supporto specifico con un argento / cloruro fili (Ag / AgCl) per collegare la soluzione pipetta ad un amplificatore intracellulare (tramite una fase testa). Il supporto deve essere collegato a un micromanipolatore. Posizionare un elettrodo di riferimento Ag / AgCl sui muscoli del collo del ratto.
  3. Inserire lentamente la pipetta nel cervello fino alla regione di interesse e verificare la resistenza monitorando la caduta di tensione in risposta ai passi attuali. Utilizzare il ronzio (o zapping) Pulsante dell'amplificatore per cancellare la pipetta, se necessario.
  4. Usare tamponi di cotone o triangoli di assorbimento di sintesi per asciugare la craniotomia (fare attenzione a non toccare la ECoG o elettrodi intracellulari) prima di coprirla con elastomeri di silicone o 4% agarosio per ridurre i movimenti del cervello.
  5. Abbassare la pipetta in 1 - 2 micron passi fino a quando la sua resistenza aumenta quando si avvicina una cella. Quindi utilizzare la funzione ronzio dell'amplificatore di penetrazioneTE nel neurone.

3. Indurre lo Stato isoelettrico

  1. Eseguire il protocollo sperimentale appropriata (ad esempio, correnti sparare risposte a iniettare all'interno delle cellule, le relazioni corrente-tensione, risposte stimoli sensoriali), in questa fase, mentre il monitoraggio contemporaneamente potenziale di membrana del neurone, la ECoG e le variabili fisiologiche.
  2. Assicurarsi che l'elettrodo intracellulare è stabile nella cella analizzando la stabilità sia del potenziale di membrana e l'azione proprietà potenziali tutta la sessione di registrazione. In caso contrario, non andare al passaggio successivo e attendere che la registrazione diventa stabile di nuovo o cercare un altro neurone.
  3. Iniettare una dose elevata ma infra-letale di pentobarbital sodico (~ 90 mg / kg, può essere basso come 35 mg / kg dalla condizione iniziale pentobarbital e fino a 155 mg / kg dalla condizione iniziale fentanil) tramite la linea IP.
    Nota: Entro 15 - 20 min intracellulare e ECoG waveforms dovrebbe rallentare con silenzi elettrici intermittenti per raggiungere transitoriamente il cosiddetto "scoppio-soppressione" profilo 37,38, che crolla progressivamente ad uno stato isoelettrico completo. Si prevede che la frequenza cardiaca rallenta sensibilmente (di circa 10 - 20%), ma la SpO 2 e EtCO 2 dovrebbe rimanere relativamente stabile.
  4. Se lo stato isoelettrico non viene raggiunto, iniettare una piccola quantità di sodio pentobarbital (~ 10% della dose passo 3.1). Aspettare 15 minuti prima di aggiungere più anestetico se lo stato isoelettrico non è ancora raggiunto.
  5. Ripetere il protocollo sperimentale per confrontare l'impatto delle dinamiche di rete sulle proprietà integrative del neurone registrato.
    Nota: Dopo la cessazione delle iniezioni di anestetico, l'attività elettrica cerebrale dovrebbe recuperare completamente entro 3 o 4 ore.
  6. Alla fine dell'esperimento, iniettare una dose letale di pentobarbital sodio (200 mg / kg, IP) per eutanasia ratto.

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Risultati

Indurre e mantenere uno stato cerebrale isoelettrico è una delicata procedura sperimentale vivo. E 'stato dimostrato per essere un potente strumento per studiare direttamente l'impatto delle attività di rete corticale eccitabilità neuronale e la funzione di trasferimento 29. La Figura 1 mostra il monitoraggio multi-parametro, compresi ECoG e costanti vitali, dello stato fisiologico dell'animale prima (Figura 1A ) ...

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Discussione

Descriviamo qui un nuovo metodo per sopprimere in vivo l'attività elettrica cerebrale spontanea, sia a rete e livello cellulare. Questa procedura porta ad un estremo stato del cervello, nota come comatoso isoelettrico 41. Da un punto di vista clinico, un tale inattività electrocerebral è l'anomalia più grave che può essere visto sul EEG. Si tratta per lo associato ad un coma irreversibile, con tutti i pazienti o morire o continuare in uno stato vegetativo persistente 42, ma può ess...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla Fondation de France, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l'Università Pierre e Marie Curie e il programma 'Investissements d'avenir' ANR-10-IAIHU-06.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sodio PentobarbitalCentravetPentobarbital
Ketamina 500MerialImalgö ne 500
Fentanyl Janssen-CilagFentanyl
XylocaineCentravetXylovet
Gallamine triethiodureSigmaG8134
ECoG amplifierA-M SystemsAmplificatore AC, modello 1700
Amplificatore intracellulareMolecular DevicesAxoclamp 900A
Interfaccia di acquisizione datiCambridge Electronic DesignPotenza CED 1401-3 
Software di analisi datiCambridge Electronic DesignSpike2 versione 7
micromanipolatoreScientificaIVM-3000
Estrattore capillareNarishigePE-2
Capillari in vetro borosilicatoHarvard ApparatusGC150F-10
Filo d'argento 0,125 mm (registrazione intracellulare)WPIAGT0525
Riferimento Ag-AgClPhymepE242
Filo d'argento 0,25 mm (registrazione ECoG)WPIAGT1025
Sistema di respirazione artificialeMinerveAlpha Lab
Monitoraggio dei parametri fisiologiciDigicareLifeWindow Lite
Coperta riscaldanteHarvard Apparatus507215
StereomicroscopioLeicaM80
ForbiciFST15005-08
Pinze Dumont #5FST11295-10
Pinze Dumont #5SFFST11252-00
IP Catetere in poliuretano - 0,43x0,69 mm  InstechBTPU-027
Elastomero siliconicoWPIKWIK-CAST
Trapano odontoiatricoNSKY1001151 e P496
Colla chirurgica3Mvetbond

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