A indução de um Estado Isoeléctrico cérebro para investigar o impacto da endógena Synaptic Activity na excitabilidade neuronal<em> In Vivo</em
Summary
Este procedimento executa longa duração in vivo gravações intracelulares de neurônios individuais durante os estados cerebrais fisiologicamente relevantes e após a abolição completa das atividades elétricas em curso, resultando em um estado cerebral isoelétrico. As constantes fisiológicas do animal são cuidadosamente monitorizado durante a transição para o estado de coma artificial.
Abstract
A informação de processo maneira neurónios depende tanto nas suas propriedades intrínsecas de membrana e sobre a dinâmica da rede sináptica aferente. Em particular, a actividade de rede endogenamente-gerado, que varia fortemente em função do estado de vigilância, modula significativamente neuronal computação. Para investigar como as diferentes dinâmicas cerebrais espontâneos impacto propriedades integrativas dos neurônios individuais, desenvolvemos uma nova estratégia experimental no rato que consiste na supressão in vivo toda a atividade cerebral por meio de uma injeção sistêmica de uma alta dose de pentobarbital de sódio. actividades corticais, continuamente monitorizados pelo eletrocorticograma combinada (ECoG) e gravações intracelulares são progressivamente retardado, conduzindo a um perfil constante isoeléctrica. Este estado cerebral extrema, colocando o rato em uma em coma profundo, foi cuidadosamente monitorizada através da medição das constantes fisiológicas do animal ao longo das experiências. r intracelularecordings nos permitiu caracterizar e comparar as propriedades de integração do mesmo neurônio incorporado dinâmica corticais fisiologicamente relevantes, tais como as verificadas no ciclo vigília-sono, e quando o cérebro estava completamente silenciosa.
Introduction
Na ausência de quaisquer estímulos ambientais ou tarefas comportamentais, o "repouso" cérebro gera um fluxo contínuo de actividade eléctrica que pode ser gravada a partir do couro cabeludo, como electroencefalográficas ondas (EEG). O correlato intracelular desta actividade cerebral endógena é caracterizado por as flutuações de tensão de membrana fundo (também conhecidos como "ruído sináptica"), que são compostas por uma combinação de potenciais sinápticos excitatórios e inibidores que reflectem a actividade em curso de redes aferentes 1,2. Esta atividade espontânea varia em frequência e amplitude com os diferentes estados de vigilância. Elucidar o impacto da atividade de rede na excitabilidade e capacidade de resposta dos neurônios individuais é um dos grandes desafios da neurociência 3,4.
Muitos estudos experimentais e computacionais têm explorado o impacto funcional da atividade sináptica em curso sobre a propertie integrativas dos neurônios. No entanto, o papel dos diferentes parâmetros neuronais afectadas pelo ruído de fundo sináptica permanece elusiva. Por exemplo, o nível médio de despolarização da membrana foi encontrada positivamente ou negativamente 5,6 7-9 correlacionada com a capacidade de entradas sensoriais para desencadear potenciais de acção. Além disso, ao passo que algumas investigações sugerem que as flutuações do potencial de membrana, o que resulta de uma corrente que varia continuamente de entradas sinápticas aferentes, afectar fortemente a capacidade de resposta de neurónios individuais, modulando o ganho da sua relação de entrada-saída de 3,10-13, indicam que outros mudanças na condutância da membrana entrada mediadas por inibição de manobra são suficientes para modular o ganho neuronais, independentemente da magnitude das flutuações de membrana 14,15. Finalmente, estudos recentes realizados em animais acordados sublinhou como o processamento da informação sensorial no único neurônio depende criticamente sobre o estado de vigilância and a corrente 16,17 demanda comportamental.
Uma estratégia simples para elucidar o papel funcional de um determinado processo em um sistema altamente interligada é determinar como a sua ausência especificamente altera o funcionamento do sistema. Este método tem sido amplamente utilizado em pesquisa neuroscience, por exemplo, utilizando as lesões experimentais ou inactivação de diferentes áreas do cérebro, 18-21 ou bloqueio farmacológico de canais iónicos específicos 22,23. Notavelmente, ela foi aplicada in vivo para desvendar como funcionais de conectividade e de rede dinâmica afetar computação única célula 24-27. No entanto, até à data manipulações locais destinados para bloquear o disparo de neurônios e / ou perturbar as suas propriedades biofísicas básicos podem ser parcialmente eficazes e estão limitados a volumes relativamente pequenos cerebrais 28.
Para superar essas limitações, desenvolvemos uma nova abordagem experimental em vivo emo rato para comparar as propriedades eletrofisiológicas de neurônios individuais gravados em um determinado estado do cérebro, ou seja, inseridos em uma rede particular dinâmica, aos obtidos após a supressão completa de todo o cérebro atividade sináptica 29. Nas condições de controlo, duas dinâmicas corticais distintos poderiam ser gerados. eletrocorticográfica (ECoG) padrões de sono-like foram induzidas pela injeção de doses moderadas de pentobarbital de sódio. Alternativamente, ondas rápidas ECoG de pequena amplitude comparável à actividade cortical subjacente ao estado de vigília (-vigília como padrão) pode ser produzido por injecção de fentanil. Subsequentemente, enquanto se mantém a mesma ECoG e gravação intracelular, um silenciamento completa da actividade eléctrica do cérebro endógeno foi obtido por injecção sistémica de uma dose elevada de pentobarbital de sódio, caracterizado por ECoG isoeléctrico e actividades intracelulares. Uma vez que a indução de um estado de coma, tais extrema poderiam potencialmente fatal tem consequenCES sobre as funções biológicas, um acompanhamento cuidadoso e contínuo das variáveis fisiológicas era essencial. Portanto, meticulosamente seguido da frequência de batimento cardíaco, a concentração final da expiração de CO 2 (ETCO2), a saturação de O2 (SpO 2) e a temperatura central do rato ao longo das experiências.
Nós avaliamos neurônios individuais propriedades durante estes estados diferentes, utilizando microeléctrodos afiadas, que são particularmente adequados para gravações longas e estáveis in vivo. O processo descrito aqui, pode ser combinada com outras abordagens electrofisiológicos e de imagem e pode ser alargado a outros modelos animais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos aqui um novo método para suprimir a atividade elétrica cerebral espontânea vivo, tanto da rede e níveis celulares. Este procedimento leva a um estado cerebral extremo, conhecido como comatoso isoelétrico 41. De um ponto de vista clínico, uma inactividade tais electrocerebral é a anormalidade mais grave que pode ser visto no EEG. É, sobretudo, associado a um coma irreversível, com todos os pacientes morrendo ou continuadas em um estado vegetativo persistente 42,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fondation de France, o Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale, o Curie Universidade Pierre & Marie e do programa «Investissements d'avenir 'ANR-10-IAIHU-06.
Materials
| Sodium Pentobarbital | Centravet | Pentobarbital | |
| Ketamine 500 | Merial | Imalgène 500 | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag | Fentanyl | |
| Xylocaine | Centravet | Xylovet | |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134 | |
| ECoG amplifier | A-M Systems | AC amplifier, Model 1700 | |
| Intracellular amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | |
| Data acquisition interface | Cambridge Electronic Design | CED power 1401-3 | |
| Data analysis software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 7 | |
| micromanipulator | Scientifica | IVM-3000 | |
| Capillary Puller | Narishige | PE-2 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-10 | |
| Silver wire 0.125mm (intracellular recording) | WPI | AGT0525 | |
| Ag-AgCl reference | Phymep | E242 | |
| Silver wire 0.25mm (ECoG recording) | WPI | AGT1025 | |
| Artificial respiration system | Minerve | Alpha Lab | |
| Physiological parameters monitoring | Digicare | LifeWindow Lite | |
| Heating Blanket | Harvard Apparatus | 507215 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Scissors | FST | 15005-08 | |
| Forceps Dumont #5 | FST | 11295-10 | |
| Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-00 | |
| IP Polyurethane catheter – 0.43×0.69mm | Instech | BTPU-027 | |
| Silicon elastomere | WPI | KWIK-CAST | |
| Dental drill | NSK | Y1001151 and P496 | |
| Surgical glue | 3M | vetbond |
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