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Neuroscience

等電点電気泳動脳の状態の誘導は、神経細胞の興奮に内因性シナプス活性の影響を調査するために、<em>インビボ</em

Published: March 31, 2016
doi:
10.3791/53576
, , , ,
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127,Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

この手順では、等電脳の状態で、その結果、生理学的に関連する脳の状態の間、継続的な電気的活動の完全な廃止後に単一ニューロンからの長期的なin vivoでの細胞内記録を行います。動物の生理学的定数は慎重に人工的な昏睡状態への移行中に監視されています。

Abstract

方法ニューロンのプロセス情報は、それらの固有の膜特性上および求心性シナプスのネットワークのダイナミクスの両方に依存します。特に、強い警戒の状態の関数として変化する内因的に生成されたネットワーク活動は、有意に神経の計算を調節します。自発的な脳のダイナミクスが単一ニューロン「統合的特性に与える影響を、異なる調査するために、我々は、ペントバルビタールナトリウムの高用量の全身注射によって、 生体内でのすべての脳の活性を抑制することからなるラットにおける新しい実験戦略を開発しました。継続的に組み合わせた皮質脳波（ECOG）と細胞内記録によって監視皮質の活動は、次第に安定した等電点電気泳動プロファイルにつながる、鈍化しています。深い昏睡状態にラットを入れ、この極端な脳の状態は、注意深く実験を通して動物の生理学的定数を測定することによってモニターしました。細胞内Recordingsは、私たちは、このような睡眠 – 覚醒サイクルに遭遇するなどの生理学的に関連する皮質ダイナミクス、中に埋め込まれた同じニューロンの統合的な性質を特徴づけると比較させ、脳は完全に沈黙していたとき。

Introduction

任意の環境刺激または行動作業の非存在下では、脳は、脳波（EEG）波として、頭皮の記録可能な電気活動の連続的なストリームを生成する「休止」。この内因性の脳活動の細胞内相関は、求心性のネットワーク1,2の継続的な活動を反映し、興奮性と抑制性シナプス電位の組み合わせで構成されている（また、「シナプスノイズ」として知られている）背景膜電圧の変動によって特徴付けられます。この自発的な活動は、警戒の異なる状態で周波数と振幅で変化します。単一ニューロンの興奮性と応答性にネットワーク活動の影響を解明することは神経科学3,4の主要な課題の一つです。

多くの実験と計算の研究では、統合propertie上の継続的なシナプス活性の機能的影響を検討していますニューロンの秒。しかし、背景シナプスノイズの影響を受け、異なる神経細胞のパラメータの役割は、とらえどころのないままになります。例えば、膜の脱分極の平均レベルは、正に5,6または負7-9活動電位を誘発する感覚入力の能力と相関が見出されました。また、いくつかの調査は他の人がいることを示し、求心性シナプス入力の連続的に変化する流れに起因する膜電位の変動は、強くその入出力関係3,10-13のゲインを調節することによって、単一ニューロンの応答性に影響を与えることを示唆しているのに対し、阻害シャントによって媒介される膜入力コンダクタンスの変化にかかわらず、膜変動14,15の大きさのニューロンの利得を調節するのに十分です。最後に、目を覚まし動物で行われた最近の研究では、単一ニューロンにおける感覚情報の処理が非常に警戒aの状態に依存してどのように強調しましたndは現在の行動の需要16,17。

高度に相互接続システム内の指定されたプロセスの機能的役割を解明する簡単な戦略は、その不在は、具体的にシステムの機能を変化させる方法を決定することです。この方法は、広く実験的病変または異なる脳領域18-21の不活性化、または特定のイオンチャネル22,23の薬理学的遮断を使用して、たとえば、神経科学の研究に用いられてきました。特に、機能的接続性とネットワークダイナミクスは、単一のセルの計算24-27にどのように影響するかを明らかにするために、in vivoで適用されています。しかし、今日まで、ニューロンの発火を阻止および/ ​​またはそれらの基本的な生物物理学的特性を摂動することを意図するものでローカル操作は部分的に有効であることができ、比較的小さな脳容積28に限定されています。

これらの制限を克服するために、我々は、新たなインビボ実験的アプローチを開発しました指定された脳の状態で記録された単一神経細胞の電気生理学的特性を比較するために、ラット、 すなわち、全脳のシナプス活動29の完全な抑制後に得られたものに、動的な特定のネットワークに埋め込 ​​まれました。制御条件において、二つの異なる皮質ダイナミクスを生成することができます。睡眠のようなelectrocorticographic（ECOG）のパターンは、ペントバルビタールナトリウムの適度な用量の注射によって誘発されました。また、覚醒状態（覚醒状パターン）を根底にある皮質の活動に匹敵する小振幅の高速ECOG波はフェンタニルの注入によって生成することができます。同じECOG細胞内記録を維持しながら、続いて、内因性の脳の電気的活動の完全なサイレンシングは、等電ECOGと細胞内活動によって特徴付けられる、ペントバルビタールナトリウムの高用量の全身注射によって得られました。このような極端な昏睡状態の誘導は、潜在的に致命的なconsequenを持っている可能性があるため生物学的機能上のCESは、生理学的変数の慎重かつ継続的な監視が不可欠でした。したがって、我々は細心の注意を払って実験を通じてハートビート周波数、呼気終末CO 2濃度（のEtCO 2）、O 2飽和度（SpO 2）およびラットの中心温度を追いました。

我々は、in vivoでの長期かつ安定した録音のために特に適している鋭い微小電極を使用して、これらの異なる状態の間に単一ニューロンの特性を評価します。ここで説明する手順は、他の電気生理学的およびイメージング手法と組み合わせることができ、他の動物モデルに拡張することができます。

Protocol

すべての手順は、欧州連合（指令63分の2010 / EU）のガイドラインに沿って行われ、動物実験でのチャールズ・ダーウィン倫理委員会によって承認されました。我々は、しかし、ほとんどの手順は、すべての人の特定のニーズにマッチするように適合させることができ、ここで私たちは日常的に我々の研究室で使用する手順について説明します。 1.外科の準備<p class="jove_c…

Representative Results

等電脳の状態を誘導し、維持することは、インビボ実験手順で繊細です。直接神経細胞の興奮と伝達関数29に皮質ネットワーク活動の影響を研究するための強力なツールであることが証明されている。 図1は、ECOGと重要な定数を含むマルチパラメータモニタリングを示し、動物の生理的状態の（ 図1Aの前に等電状態の）?…

Discussion

ここでは、ネットワークと細胞レベルの両方で生体内自発的な脳の電気的活動に抑制するための新しい方法を説明します。この手順は、等電昏睡41として知られている極端な脳の状態をもたらします。臨床的観点からは、そのようなelectrocerebral非アクティブは、EEG上で見ることができる最も深刻な異常です。これは、主にどちらか死んまたは遷延性植物状態42に?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、財団・ド・フランス、研究所国立・デ・ラ・サンテエ・デ・ラ・RECHERCHEMédicale、ピエール＆マリー・キュリー大学とプログラムのINVESTISSEMENTSドールアベニール「ANR-10-IAIHU-06からの助成金によってサポートされていました。

Materials

Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter – 0.43×0.69mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond
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References

  1. Fatt, P., Katz, B. Some observations on biological noise. Nature. 166 (4223), 597-598 (1950).
  2. Brock, L. G., Coombs, J. S., Eccles, J. C. The recording of potentials from motoneurones with an intracellular electrode. J. Physiol. 117 (4), 431-460 (1952).
  3. Destexhe, A., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  4. Silver, R. A. Neuronal arithmetic. Nat. Rev. Neurosci. 11 (7), 474-489 (2010).
  5. Azouz, R., Gray, C. M. Cellular mechanisms contributing to response variability of cortical neurons in vivo. J. Neurosci. 19 (6), 2209-2223 (1999).
  6. Sanchez-Vives, M. V., Nowak, L. G., McCormick, D. A. Membrane Mechanisms Underlying Contrast Adaptation in Cat Area 17 In Vivo. J. Neurosci. 222 (11), 4267-4285 (2000).
  7. Petersen, C. C. H., Hahn, T. T. G., Mehta, M., Grinvald, A., Sakmann, B. Interaction of sensory responses with spontaneous depolarization in layer 2/3 barrel cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (23), 13638-13643 (2003).
  8. Sachdev, R. N. S., Ebner, F. F., Wilson, C. J. Effect of Subthreshold Up and Down States on the Whisker-Evoked Response in Somatosensory Cortex. J. Neurophysiol. 92 (6), 3511-3521 (2004).
  9. Hasenstaub, A., Sachdev, R. N. S., McCormick, D. A. State Changes Rapidly Modulate Cortical Neuronal Responsiveness. J. Neurosci. 27 (36), 9607-9622 (2007).
  10. Chance, F. S., Abbott, L. F., Reyes, A. D. Gain modulation from background synaptic input. Neuron. 35 (4), 773-782 (2002).
  11. Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T., McCormick, D. A. Barrages of synaptic activity control the gain and sensitivity of cortical neurons. J. Neurosci. 23 (32), 10388-10401 (2003).
  12. Mitchell, S. J., Silver, R. A. Shunting inhibition modulates neuronal gain during synaptic excitation. Neuron. 38 (3), 433-445 (2003).
  13. Prescott, S. A., De Koninck, Y. Gain control of firing rate by shunting inhibition: roles of synaptic noise and dendritic saturation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 2076-2081 (2003).
  14. Graham, L. J., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and IBK in Rat and Cat Cortex. Dynamic-clamp: From principles to applications. , (2009).
  15. Fernandez, F. R., White, J. A. Gain control in CA1 pyramidal cells using changes in somatic conductance. J. Neurosci. 30 (1), 230-241 (2010).
  16. Polack, P. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat. Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  17. Zhou, M., Liang, F., et al. Scaling down of balanced excitation and inhibition by active behavioral states in auditory cortex. Nat. Neurosci. 17 (6), 841-850 (2014).
  18. Contreras, D., Destexhe, A., Sejnowski, T. J., Steriade, M. Spatiotemporal Patterns of Spindle Oscillations in Cortex and Thalamus. J. Neurosci. 17 (3), 1179-1196 (1997).
  19. Charpier, S., Mahon, S., Deniau, J. M. In vivo induction of striatal long-term potentiation by low-frequency stimulation of the cerebral cortex. Neuroscience. 91 (4), 1209-1222 (1999).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and Mechanisms of Wakefulness on Local Cortical Networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  21. Poulet, J. F. A., Fernandez, L. M. J., Crochet, S., Petersen, C. C. H. Thalamic control of cortical states. Nat. Neurosci. 15 (3), 370-372 (2012).
  22. Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition. , (2001).
  23. Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (2009).
  24. Ferster, D., Chung, S., Wheat, H. Orientation selectivity of thalamic input to simple cells of cat visual cortex. Nature. 380 (6571), 249-252 (1996).
  25. Paré, D., Shink, E., Gaudreau, H., Destexhe, A., Lang, E. J. Impact of spontaneous synaptic activity on the resting properties of cat neocortical pyramidal neurons In vivo. J. Neurophysiol. 79 (3), 1450-1460 (1998).
  26. Destexhe, A., Paré, D. Impact of network activity on the integrative properties of neocortical pyramidal neurons in vivo. J. Neurophysiol. 81 (4), 1531-1547 (1999).
  27. Kara, P., Pezaris, J. S., Yurgenson, S., Reid, R. C. The spatial receptive field of thalamic inputs to single cortical simple cells revealed by the interaction of visual and electrical stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (25), 16261-16266 (2002).
  28. Lomber, S. G. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. J. Neurosci. Meth. 86 (2), 109-117 (1999).
  29. Altwegg-Boussac, T., Chavez, M., Mahon, S., Charpier, S. Excitability and responsiveness of rat barrel cortex neurons in the presence and absence of spontaneous synaptic activity in vivo. J. Physiol. 592 (16), 3577-3595 (2014).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl. Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates (2nd edn). , (1986).
  32. Wolfensohn, S. . Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. , (2013).
  33. Bester, H., Chapman, V., Besson, J. M., Bernard, J. F. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. J. Neurophysiol. 83 (4), 2239-2259 (2000).
  34. Greene, S. A. . Veterinary Anesthesia and Pain Management Secrets. , (2002).
  35. Morgan, B. J., Adrian, R., Bates, M. L., Dopp, J. M., Dempsey, J. A. Quantifying hypoxia-induced chemoreceptor sensitivity in the awake rodent. J. Appl. Physiol. 117 (7), 816-824 (2014).
  36. Mahon, S., Deniau, J. M., Charpier, S. Relationship between EEG potentials and intracellular activity of striatal and cortico-striatal neurons: an in vivo study under different anesthetics. Cereb. Cortex. 11 (4), 360-373 (2001).
  37. Ganes, T., Lundar, T. The effect of thiopentone on somatosensory evoked responses and EEGs in comatose patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 46 (6), 509-514 (1983).
  38. Schmid-Elsaesser, R., Schröder, M., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. EEG burst suppression is not necessary for maximum barbiturate protection in transient focal cerebral ischemia in the rat. J. Neurol. Sci. 162 (1), 14-19 (1999).
  39. Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J Clin Invest. 91 (2), 608-615 (1993).
  40. Gu, X. Q., Kanaan, A., Yao, H., Haddad, G. G. Chronic High-Inspired CO2 Decreases Excitability of Mouse Hippocampal Neurons. J. Neurophysiol. 97 (2), 1833-1838 (2007).
  41. Lehembre, R., Gosseries, O., et al. Electrophysiological investigations of brain function in coma, vegetative and minimally conscious patients. Arch Ital Biol. 150 (2/3), 122-139 (2012).
  42. Husain, A. M. Electroencephalographic assessment of coma. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 208-220 (2006).
  43. Fink, E. L., Alexander, H., et al. An Experimental Model of Pediatric Asphyxial Cardiopulmonary Arrest in Rats. Pediatr Crit Care Med. 5 (2), 139-144 (2004).
  44. Lukatch, H. S., McIver, M. B. Synaptic mechanisms of thiopental-induced alterations insynchronized cortical activity. Anesthesiology. 84, 1425-1434 (1996).
  45. Kroeger, D., Amzica, F. Hypersensitivity of the anesthesia-induced comatose brain. J Neurosci. 27, 10597-10607 (2007).
  46. Kroeger, D., Florea, B., Amzica, F. Human brain activity patterns beyond the isoelectric line of extreme deep coma. PLoS ONE. 8 (9), e75257 (2013).
  47. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Arch. 444 (4), 491-498 (2002).
  48. DeWeese, M. Whole-Cell Recording In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. , (2007).
  49. Schramm, A. E., Marinazzo, D., Gener, T., Graham, L. J. The Touch and Zap Method for In Vivo Whole-Cell Patch Recording of Intrinsic and Visual Responses of Cortical Neurons and Glial Cells. PLoS ONE. 9 (5), e97310 (2014).
  50. Mahon, S., Charpier, S. Bidirectional Plasticity of Intrinsic Excitability Controls Sensory Inputs Efficiency in Layer 5 Barrel Cortex Neurons in Vivo. J. Neurosci. 32 (33), 11377-11389 (2012).
  51. Destexhe, A., Rudolph, M., Paré, D. The high-conductance state of neocortical neurons in vivo. Nat. Rev. Neurosci. 4 (9), 739-751 (2003).

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Altwegg-Boussac, T., Mahon, S., Chavez, M., Charpier, S., Schramm, A. E. Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo. J. Vis. Exp. (109), e53576, doi:10.3791/53576 (2016).
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