JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

Published: January 26, 2016
doi:
10.3791/53589
,
1Department of Chemical and Systems Biology,Stanford University School of Medicine

Summary

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Abstract

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) מעורבות באופן אינטימי כמעט בכל התהליכים הביולוגיים וצמודות למחלות רבות אנושיות. לכן, יש מאמץ גדול כדי למקד PPIs במחקר בסיסי ובתעשיית התרופות. ממשקי חלבונים הם בדרך כלל גדולים, שטוחים, ולעתים קרובות חוסר כיסים, מסבך את הגילוי של מולקולות קטנות המתמקדות באתרים כאלה. יש גישות אלטרנטיביות מיקוד באמצעות נוגדני מגבלות בשל זמינות ביולוגית ירודה אוראלית, תא-חדירות נמוכות, וחוסר יעילות ייצור.

יש שימוש בפפטידים למקד ממשקי PPI מספר יתרונות. יש לי פפטידים גמישות קונפורמציה גבוהה יותר, הסלקטיביות מוגברת, והם בדרך כלל זולים. עם זאת, יש לי פפטידים מגבלות משלהם, כולל יציבות עניה וקרום תא חוסר יעילות חצייה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, ניתן לבצע cyclization פפטיד. Cyclization הודגם לשפר סלקטיביות פפטיד, יציבות מטבולית, וזמינות ביולוגית. עם זאת, ניבוי קונפורמציה ביו של פפטיד מחזורי הוא לא טריוויאלי. כדי להתגבר על האתגר הזה, גישה אטרקטיבית אחד אותו למסך ספרייה ממוקדת למסך שבו יש את כל פפטידים מחזורי עמוד השדרה באותו רצף ראשוני, אך שונות בפרמטרים המשפיעים על קונפורמציה, כגון גודל טבעת ומיקום.

אנו מתארים פרוטוקול מפורט לסינתזה של פפטידים ספרייה מחזוריים עמוד השדרה מיקוד PPIs טפיל הספציפי. שימוש בגישה עיצוב רציונלים, שפיתחנו פפטידים הנגזרים מקולט eishmania L חלבון הפיגום לC-קינאז מופעל (חוסר). חוקרים שערנו כי רצפים בחוסר הנשמרים בטפילים, אבל לא בhomolog מארח היונקים, עשויים לייצג אתרי אינטראקציה לחלבונים שהם קריטיים ליכולת הקיום של הטפילים. פפטידים מחזוריים היו מסונתזים באמצעות קרינת מיקרוגל כדי להפחית את זמני תגובה ולהגדיליְעִילוּת. פיתוח ספרייה של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה בגדלים שונים טבעת מאפשר מסך שיטתי לקונפורמציה הפעילה הביולוגית ביותר. שיטה זו מספקת דרך כללית, מהירה, וקלילה לסנתז פפטידים מחזוריים.

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) לשחק תפקיד מרכזי ברוב התהליכים ביולוגיים, מהעברת אותות תאיות לתא המוות 1. לפיכך, מיקוד PPIs הוא בעל חשיבות עליונה למחקר בסיסי ויישומים טיפוליים. יכול להיות מוסדר על ידי PPIs נוגדנים ספציפיים ויציבים, אבל נוגדנים הם יקרים וקשים לייצר ויש זמינות ביולוגית ירודה. לחלופין, יכול להיות ממוקד PPIs על ידי מולקולות קטנות. מולקולות קטנות קלות יותר לסנתז וזולים בהשוואה לנוגדנים; עם זאת, הם יחסית פחות גמישים ולהתאים טובים יותר לחללים קטנים יותר לממשקי חלבון-חלבון גדול 2,3. מחקרים שונים הראו כי פפטידים, שהם פשוט יותר וזולים יותר מאשר נוגדנים וגמישים יותר ממולקולות קטנות, יכולים להיקשר ממשקי חלבון ולהסדיר PPIs 4,5. שוק פפטיד הטיפולי העולמי מוערך כרבע מליארד דולרים בשינה 2013, והוא גדל annua 10.5%lly 6. יתר על כן, יש יותר מ -50 פפטידים משווקים, סביב 270 פפטידים בשלבים שונים של ניסויים קליניים, ופפטידים כ -400 בשלבים פרה-קליניים מתקדמים 7. למרות פפטידים רבים נמצאים בשימוש כתרופות, פפטידים עדיין מהווים מספר אתגרים המגבילים את היישום הנרחב שלהם, כולל זמינות ביולוגית ירודה ויציבות, חוסר יעילות בקרום תא מעבר, וגמישות קונפורמציה 8,9. חלופה אחת להתגבר על החסרונות אלה היא להחיל שינויים שונים כגון (חומצת אמינו וD-N-אלקילציה) מקומיות והגלובלי (cyclization) אילוצים 8,10-12. שינויים אלה להתרחש גם באופן טבעי. לדוגמא, ציקלוספורין, פפטיד הטבעי מחזורי לדיכוי מערכת חיסון, מכיל חומצת אמינו בודדת D-ועובר שינויי N-אלקילציה 13,14.

שינוי של חומצות אמינו טבעיות כדי לגרום לאילוצים מקומיים, כגון D- וN-אלקילציה, לעתים קרובות משפיע על פפטיד9; של פעילות ביולוגית. עם זאת, cyclization, שבו הרצף של עניין יכול להישאר אותו הדבר, יש יותר סיכוי לשמור על פעילות ביולוגית. Cyclization היא דרך אטרקטיבית מאוד להגביל את מרחב קונפורמציה פפטיד על ידי הפחתת שיווי המשקל בין תצורות שונות. בדרך כלל זה מגביר את הפעילות והסלקטיביות ביולוגיות על ידי הגבלת פפטיד לקונפורמציה הפעילה שמתווכת רק פונקציה אחת. Cyclization גם משפר את יציבות פפטיד על ידי שמירה על פפטיד בקונפורמציה שפחות מוכרת על ידי אנזימים משפילים. ואכן, פפטידים מחזוריים הוצגו השתפרו יציבות מטבולית, זמינות ביולוגית, וסלקטיביות בהשוואה לעמיתיהם ליניארי שלהם 15-17.

עם זאת, cyclization יכולה להיות חרב פיפיות שכן במקרים מסוימים ההגבלה עלולה למנוע פפטידים מהשגת קונפורמציה ביו. כדי להתגבר על מכשול זה, ספרייה ממוקדת שבו יש את כל פפטידים אותו sequenc העיקרייכול להיות מסונתז pharmacophores דואר וכתוצאה מכך קבוע. פפטידים בספרייה שונים בפרמטרים המשפיעים על המבנה שלהם, כגון גודל טבעת ומיקום, על מנת להקרין לאחר מכן לקונפורמציה ביו ביותר 9,18.

יכולים להיות מסונתזים פפטידים הן בפתרון ועל ידי גישת סינתזת פפטיד מוצק שלב (SPPS), שנמצא כעת גישת סינתזת פפטיד הנפוצה יותר ויידון נוסף. SPPS הוא תהליך שבו שינויים כימיים מבוצעים על תמיכה מוצקה באמצעות מקשר להכין מגוון רחב של תרכובות סינתטיות 19. SPPS מאפשר פפטידים הרכבה על ידי צימוד רצוף של חומצות אמינו באופן הדרגתי מC-הסופית, שמצורף לתמיכה מוצקה, לN-הסופית. הצד-השרשרות של חומצות N-α-אמינו חייבים להיות רעול פנים עם הגנה על קבוצות שהם יציבים בתנאי תגובת שימוש במהלך התארכות פפטיד כדי להבטיח את התוספת של חומצת אמינו אחת לרח 'EP. בשלב האחרון, פפטיד הוא שוחרר מהשרף והצד-שרשרת הגנה על קבוצות יוסרו במקביל. בעוד פפטיד הוא להיות מסונתז, ניתן להסיר את כל חומרים כימיים המסיסים ממטריצת תמיכת פפטיד המוצק על ידי סינון ונשטפו בסוף כל שלב צימוד. עם מערכת כזו, עודף גדול של חומרים כימיים בריכוז גבוה יכול לנהוג תגובות צימוד להשלמה וניתן לבצע את כל שלבי הסינתזה באותו הכלי ללא כל העברה של חומר 20.

למרות שיש כמה מגבלות SPPS כגון הייצור של תגובות לא שלמות, תגובות לוואי, חומרים כימיים טמאים, כמו גם קשיי ניטור התגובה 21, את היתרונות של SPPS עשו את זה "תקן הזהב" לסינתזת פפטיד. יתרונות אלה כוללים את האפשרות לשלב חומצות אמינו שאינם טבעיות, אוטומציה, טיהור קלה, הפסדים פיזיים ממוזערים, ושימוש בחומרים כימיים עודפים, וכתוצאה מכךתשואות גבוהות. SPPS הוכח להיות שימושי מאוד בסינתזה של רצפים קשים 21,22, שינויי ניאון 23, וספריות פפטיד 24,25. SPPS הוא גם מאוד שימושי עבור מכלולים מרובה שרשרת אחרות כגון oligonucleotides 26,27, אוליגוסכרידים 28,29, וחומצות גרעין פפטיד 30,31. מעניין לציין, שבמקרים מסוימים, SPPS הוצג להיות יתרון עבור סינתזת מולקולות קטנות שנעשות באופן מסורתי בפתרון 32,33. SPPS משמש הוא בקנה מידה קטנה למחקר והוראה 34,35, כמו גם בקנה מידה גדולה בתעשייה 36-38.

שתי אסטרטגיות סינתזה המשמשות בעיקר במתודולוגיה SPPS לסינתזה של פפטידים הן butyloxycarbonyl (בוק) ו9-fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC). האסטרטגיה המקורית הציגה לSPPS הייתה בוק, אשר דורש תנאי חומצה חזקים כדי להסיר צד שרשרת הגנה על קבוצות ולדבוק פפטיד מresin. סינתזת פפטיד מבוססת FMOC, לעומת זאת, מנצלת תנאי בסיס מתונים והיא אלטרנטיבה מתונה יותר לפרוטוקול בוק חומצה יציב 39. אסטרטגית FMOC מנצלת הגנת צד שרשרת המאונכות t-בוטיל (TBU) שהוסרה בשלב האחרון של הסינתזה תוך ביקוע פפטיד מהשרף בתנאי חומצה.

העיקרון הכללי לסינתזת פפטיד על תמיכה מוצקה מוצג באיור 1. חומצת אמינו הראשונית, רעול פנים על ידי קבוצת הגנה זמנית על N-α-הסופית, נטענת על השרף מC-סופית. קבוצת הגנת חצי קבועה כדי להסוות את שרשרת הצד משמשת גם במידת צורך (איור 1, שלב 1). הסינתזה של פפטיד היעד מורכבת מC-הסופית לN-הסופית על ידי מחזורים חוזרים ונשנים של deprotection של קבוצת הגנת N-α-הזמנית (איור 1, שלב 2) וצימוד של חומצת אמינו המוגנת הבאה (איור 1 </str אונג>, שלב 3). לאחר חומצת אמינו האחרונה נטענת (איור 1, שלב 4), פפטיד הוא ביקע מתמיכת השרף וקבוצות הגנת חצי הקבועה מוסרים (איור 1, שלב 5).

איור 1
באיור 1. תכנית כללית של סינתזת פפטיד השלב מוצקה. חומצת אמינו המוגנת-N-α מעוגנת באמצעות קבוצת carboxyl באמצעות מקשר לשרף (שלב 1). הפפטיד הרצוי מורכב באופן ליניארי מC-הסופית לN-הסופית על ידי מחזורים חוזרים ונשנים של deprotection של הקבוצה הזמנית הגנה (TPG) מN-α (שלב 2) וצימוד חומצת אמינו (שלב 3). לאחר להשיג הסינתזה (שלב 4), קבוצות חצי קבועות הגנה (SPG) הם deprotected במהלך מחשוף פפטיד (שלב 5).תקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לאחר ההרכבה של שרשרת הפפטיד המלאה, cyclization יכול להיות מושגת על ידי מספר חלופות: (א) ראש אל זנב cyclization – זו דרך נוחה אבל מוגבל שכן הוא מספק רק אפשרות אחת לcyclization (איור 2 א), cyclization (ב) באמצעות חומצות אמינו מהרצף של עניין המכילות קבוצות פונקציונליות ביו – עם זאת, השימוש בחומצות אמינו אלה עשויים להשפיע על הפעילות הביולוגית (איור 2), וcyclization (C) על ידי הוספת חומצות אמינו (אבני בניין או אחר) מבלי להפריע הרצף ביו. היכרות עם מולקולות אלה היא נפוצה שכן היא מאפשרת ייצור של ספריות ממוקדות מבלי לשנות את הרצף של עניין (איור 2 ג).

איור 2
Figure 2. אסטרטגיות cyclization פפטיד האלטרנטיבי ראש () לcyclization זנב, דרך קשר פפטידי בין C-הסופית וN-הסופית.; cyclization (ב ') בין קבוצות הפונקציונליות כגון אג"ח דיסולפיד בין שאריות ציסטאין (1), או קשר בין אמיד הרשתות בצד של ליזין לאספרטית / חומצה גלוטמית (2), או רשת צד לn- או C-סופית (3 -4); cyclization (C) על ידי הוספת חומצות אמינו נוספות או נגזרי חומצת אמינו או מולקולות קטנות, לדוגמא לפני (R0) ואחרי (R7) הרצף ביו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סינתזה משתמשת קרינת מיקרוגל לחמם תגובות, ובכך מאיץ כימי אורגנית בסיוע מיקרוגל תמורות 40,41. כימיה מיקרוגל מבוססת על היכולת של המגיב / הממס לספוגמיקרוגל אנרגיה ולהמיר אותו לחום 42. לפני הטכנולוגיה הפכה נפוצה, חסרונות עיקריים היו הצורך להתגבר, כוללים יכולת השליטה והשחזור של פרוטוקולי סינתזה וחוסר מערכות זמינות עבור פקדי טמפרטורה ולחץ נאותים 43,44. הדו"ח הראשון של סינתזת פפטיד בסיוע מיקרוגל נעשה שימוש במיקרוגל מטבח לסנתז כמה פפטידים קצרים (7-10 חומצות אמינו) עם שיפור משמעותי של יעילות הצימוד וטוהר 45. יתר על כן, אנרגיית מיקרוגל הוצגה כדי להקטין הצטברות שרשרת, להפחית תגובות צד, להגביל racemization, ולשפר את שיעורי צימוד, שהם קריטיים לכל רצפים קשים וארוכים 46-53.

כיום השימוש בקרינת מיקרוגל לסינתזה של פפטידים או תרכובות הקשורות בתמיכה מוצקה הוא נרחבת, כולל סינתזה () במים במקום ממס אורגני 54; (ב) סינתזה של פפטידים עםשינויים נפוצים לאחר translational, כגון glycopeptides 55-58 או phosphopeptides 59-61, סינתזה שקשה בדרך כלל עקב יעילות הצימוד הנמוכה של נגזרי חומצת אמינו הפריעו sterically; (ג) סינתזה של פפטידים עם שינוי בעמוד השדרה, כגון azapeptides, אשר יכול להיווצר על ידי ההחלפה של C (α) של שאריות חומצת אמינו עם אטום חנקן 62, או peptoids, הצד שמחובר לשרשרת חנקן אמיד ולא אטום Cα 63,64; סינתזה של פפטידים מחזוריים 65-71 (ד); סינתזה ו( ה) של ספריות קומבינטורית 51,72. במקרים רבים, החוקרים דיווחו יעילות גבוהה יותר וצמצום זמן סינתזה באמצעות קרינת מיקרוגל בהשוואה לפרוטוקול המקובל.

באמצעות עיצוב רציונאלי 73-75, שפיתחנו פפטידים אנטי-טפילים שנגזרו מהקולט של eishmania L הפיגום FOr מופעל C-קינאז (חוסר). חוסר ממלא תפקיד חשוב בשלב המוקדם של זיהום שושנת יריחו 76. טפילים להביע רמות נמוכות יותר של חוסר להיכשל טפילים אפילו עכברים שנפרץ חיסון 77 כמו חוסר מעורב בתהליכי טפיל איתות חיוניים וסינתזת חלבון 78. לכן, חוסר הוא חלבון מפתח פיגום 79 ויעד תרופה יקר. התמקדות ברצפים בחוסר הנשמרים בטפילים, אך לא במעמד homolog היונקים המארח, זיהינו פפטיד חומצת אמינו 8 (RNGQCQRK) שירד שושנת יריחו sp. כדאיות בתרבות.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של פפטידים עמוד השדרה מחזורית הנגזרים מרצף חלבון חוסר שתואר לעיל. פפטידים היו מסונתזים על תמיכה מוצקה באמצעות חימום במיקרוגל על ​​ידי המתודולוגיה SPPS עם פרוטוקול FMOC / TBU. פפטידים היו מצומדת לפפטיד 47-57 מוביל (YGRKKRRQRRR) TAT באמצעות אג"ח אמיד כחלק מSPPS. תחבורה של מגוון רחב של מטענים לתאים מבוססות TAT הייתה בשימוש כבר למעלה מ -15 שנים ומסירת המטען לאברונים subcellular אושרה 80. ארבעה linkers שונה, succinic ואנהידריד glutaric כמו גם adipic והחומצה pimelic, שימש לביצוע cyclization ליצור linkers חומצה קרבוקסילית של שניים עד חמישה פחמנים. Cyclization נעשה שימוש באנרגית מיקרוגל, והצעדים deprotection מחשוף וצד-שרשרת הסופיים נעשו באופן ידני ללא אנרגיית מיקרוגל. השימוש בסינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי שיפר את טוהר המוצר, הגדיל את תשואת המוצר, וצמצם את משך הזמן של הסינתזה. פרוטוקול כללי זה יכול להיות מיושם למחקרים אחרים שעושים שימוש בפפטידים להבין מנגנון מולקולרי חשוב במבחנת in vivo ולפתח תרופות פוטנציאליות למחלות בבני אדם.

Protocol

1. ציוד וריאגנטים הכנה ציוד הכנה לבצע את כל הפעולות בתוך מנדף שימוש בציוד מגן אישי מתאים. כימי לסנתז פפטידים על תמיכה מוצקה באמצעות מיקרוגל פ?…

Representative Results

כאן אנו מתארים את הפיתוח של ספרייה קטנה ממוקדת של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה שמתמקדת PPIs החיוני של הטפיל שושנת יריחו ולפעול כסוכנים נגד פרזיטים (לסקירה על פפטידים המתמקדים ב- PPI כסוכנים נגד פרזיטים 87). באמצעות הסינתזה של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה רומן, phar…

Discussion

הסינתזה של ספרייה ממוקדת של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה נגזרים מחלבון חוסר הטפיל שושנת יריחו באמצעות סינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי לחלוטין מתוארת. ספרייה ממוקדת של פפטידים מחזוריים פותחה עם pharmacophores שימור וlinkers השונים. תוספת של linkers השונים כגון אנהידריד glutaric, אנהי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לורן ואן Wassenhove, Sunhee הוואנג, ודריה מושלי-רוזן לדיונים מועילים. העבודה נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות NIH מענק RC4 TW008781-01 C-רעיון (ניצוץ) לNQ היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

Materials

REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’- Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
Diisopropylcarbodiimide (DIC)
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Name  Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams™ nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials – micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37 (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282 (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15 (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305 (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10 (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24 (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30 (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116 (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O’Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61 (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121 (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274 (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6 (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using ‘safety catch’ methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2 (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91 (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based ‘building block’ approach. Nat. Protoc. 2 (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126 (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9 (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446 (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291 (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3 (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1 (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90 (4), 526-536 (2008).
  33. O’Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10 (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84 (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79 (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis – A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2 (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29 (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37 (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5 (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34 (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57 (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20 (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27 (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5 (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13 (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11 (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7 (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8 (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71 (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12 (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14 (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85 (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7 (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4 (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7 (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51 (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75 (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10 (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14 (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2 (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20 (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28 (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7 (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268 (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198 (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6 (6), e20710 (2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259 (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13 (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45 (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60 (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6 (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33 (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32 (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39 (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36 (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41 (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28 (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58 (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52 (2), 83-90 (2006).

Tags

Backbone Cyclic Peptide LibraryAntiparasitic TherapeuticsMicrowave IrradiationProtein-protein InteractionsAmino AcidActivatorActivator BasePolypropylene CartridgeCoupling ReactionNN-dimethylformamidePiperidine1-hydroxybenzotriazoleDichloromethane1-methyl-2-pyrrolidinoneAnhydride4-DimethylaminopyridineNN-diisopropylethylamineTrifluoroacetic AcidTriisopropylsilane
check_url/53589?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image