CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
Eiwitcomplexen voeren een reeks belangrijke cellulaire functies. Ophelderen van hun niet-covalente interacties en dynamiek van het grootste belang voor het begrijpen van de rol van de complexen in biologische systemen. Terwijl de directe karakterisering van biomoleculaire assemblees in de afgelopen jaren steeds belangrijker is geworden, inheemse fractionering technieken die compatibel zijn met downstream analysetechnieken, met inbegrip van massaspectrometrie zijn, zijn nodig om deze studies verder uit te breiden. Niettemin, het veld mist een high-throughput, wide-range, high-recovery scheiding methode voor het natieve eiwit assemblages. Hier presenteren we duidelijke natieve geëlueerd vloeibare fractie insluiten elektroforese (CN-GELFrEE), wat een nieuw scheiding modaliteit voor niet-covalente eiwit samenstellen. CN-GELFrEE scheiding prestatie werd aangetoond door fractioneren complexen geëxtraheerd uit muis hart. Fracties werden verzameld gedurende 2 uur en weergegeven discrete banden variërend van ~ 30-500 kDa. Een conconsistente patroon van toenemend molecuulgewicht bandbreedte werd geobserveerd, elke variërend ~ 100 kDa. Verder latere heranalyse van natieve fracties via SDS-PAGE toonde molecuulgewicht verschuift in overeenstemming met de denaturatie van eiwitcomplexen. Daarom CN-GELFrEE werd bleek het vermogen om hoge resolutie en hoge recovery natieve scheidingen op eiwitcomplexen uit een groot molecuulgewichttraject bieden, die fracties die geschikt downstream eiwitanalyses zijn.
Introduction
De meeste biologische processen gebeurt in een cel worden bedacht door verzamelingen van eiwitten in plaats van één eiwit 1 uit te voeren. Bijgevolg, om de specifieke biologische functie van een eiwit subeenheid ontrafelen in een cel is het noodzakelijk om de structurele interacties met andere eiwitten of liganden in complexen 2 begrijpen. Echter, het bestuderen van eiwitten native, met behoud van hun niet-covalente interacties en de activiteit blijft uitdagend. Een tekortkoming van natief eiwit studies is een geschikt natief scheidingstechniek die compatibel is met verschillende stroomafwaartse eiwitanalyse technieken. Daarom heeft de recente interesse in scheidingstechnieken in staat is het karakteriseren van niet-covalente assemblages van biomoleculen fors 3 toegenomen.
Eiwit scheidingstechnieken zijn noodzakelijk om de biochemie, biofysica en diverse andere studies. Huidige inheemse scheidingstechnieken hebben intrinsic tekortkomingen die compatibiliteit te verminderen met downstream-analyses, zoals lage resolutie, lage omzet, verlies voor neerslag, en de eis van grote hoeveelheden van de eerste steekproef. Tandem affiniteitszuivering wordt gebruikt voor eiwit interactie studies, maar het moet afzonderlijk voor elk eiwit doel uitgevoerd, waardoor het onverenigbaar met high-throughput analyse 4 zijn. Gelpermeatiechromatografie 5, selectieve precipitatie met ion affiniteitschromatografie 5 en dichtheid-gradiënt scheiding 6 hebben alle inheemse scheidingen voorzien, maar zijn inherent lage resolutie technieken en vereisen hoge initiële monster bedragen.
Alternatief gel gebaseerde technieken, zoals Blue inheemse (BN) en Clear Eigen (CN) PAGE (ofwel 1-D of 2-D), weergegeven hoge resolutie scheiding. Bovendien, contrasteren met andere technieken genoemd, zowel inheemse PAGE scheidingen behouden oplosbaarheid en inheemse conformatie van een brede range van macromolecuul species, waaronder hydrofobe eiwitten. Deze mogelijkheid verbreedt verder het proteoom dekking te bereiken met deze methoden 7,8 en wordt bereikt door middel van verschillende chemie tussen CN en BN-PAGE. CN-PAGE berust gewoonlijk op zachte gebracht wasmiddelen als dragermoleculen, ter vervanging van de Coomassie Blue kleurstof in BN-PAGE. BN-PAGE, hoewel geassocieerd met een hogere resolutie, heeft kanttekeningen zoals verminderde enzymatische activiteit in de gescheiden eiwitten 8 en Coomassie molecule adduct formatie, waarbij de laatste zeer nadelig is voor downstream MS analyses 9. Beide methoden zijn echter traditioneel geassocieerd met lage terugwinning en smalle proteoom dekking voor verkleuring en gelextractie beperkingen 7.
Voor de studie van gedenatureerde eiwitten, zijn er verschillende technieken die macromolecule oplosbaarheid houden tijdens het uitvoeren van hoge-resolutie fractionering met eiwitrijke terugwinning en die verenigbaar zijn met diVerse nascheiding eiwit analysetechnieken. Gel geëlueerd vloeibare fractie Vangst Elektroforese (GELFrEE) is een van de fractionering technieken die al deze kenmerken passen. Deze methode wordt voornamelijk toegepast in high-throughput top-down proteomics studies, wat aangeeft dat het is snel en veelzijdig. In GELFrEE, eiwitten gedenatureerd en gescheiden op basis van molecuulgewicht door een buisvormige gelmatrix, kan de porositeit daarvan worden gevarieerd gebaseerd op monstervereisten en de gewenste fractionering resultaten. Fracties worden geëlueerd in de vloeistoffase, waardoor de terugwinning beperkingen geassocieerd met SDS-PAGE onder handhaving van hoge resolutie verminderen. Fractie fracties kunnen vervolgens met 1-D PAGE worden geanalyseerd op moleculair gewicht bandbreedte selectie 11. Er is grote vraag naar de voordelen verbonden aan GELFrEE in inheemse scheidingstechnieken. De hierin beschreven werkwijze, Clear Indiaans GELFrEE (CN-GELFrEE), is een inwoner aanpassing van GELFrEE. Om compatibel met een breed s zijnpectrum van macromoleculen in hun natieve toestand, deze werkwijze berust niet alleen op de zachte CN-PAGE chemie, maar ook op een porositeit gradiëntscheiding, welk eiwit precipitatie vermindert door het elimineren van de ruwe overgang tussen poreusheid aanwezig discontinue gelsystemen 9. Toegepast op eiwitcomplexen geëxtraheerd uit muizenhart fractioneren, weergegeven geëlueerde fracties hoge herstel en een hoge-resolutie scheiding van uiteenlopende molecuulgewichten werd verkregen. Verder zijn de verkregen fracties zijn compatibel met de meeste downstream biochemische en biofysische analyses eiwit.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE is afgeleid van het natieve heldere (CN) PAGE buffersysteem dat een mengsel van anionische en neutrale wasmiddelen als dragermoleculen voor 9 molecuulgewicht-eiwitten fractionering gebruikt door een gelmatrix. De toepassing van de GN-GELFrEE om een native muis hart eiwit extract gegenereerd lage complexiteit fracties met discrete bandbreedtes met behoud van niet-covalente interacties van biomoleculaire assemblies. Vergelijking van fracties tussen CN-PAGE en reducerende SDS-PAGE toonde plaatge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De WM Keck Foundation royaal verstrekte financiering voor dit werk. Dit materiaal is gebaseerd op het werk ondersteund door FAPERJ onderzoek subsidie 100,039 / 2014 van de regering van Rio de Janeiro – Brazilië voor RDM, Science without Borders beurs 88.888,075416 / 2013-00 van het Coördinatieorgaan voor de verbetering van het hoger onderwijs personeel, onder de regering van Brazilië, voor HSS, de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder fellowship nummer 2014171659 voor OSS, en door CNPq onderzoek subsidie 202.011 / 2012-7 van de regering van Brazilië voor LHFDVPCH is een ontvanger van een Northwestern University's Chemistry of levensprocessen Institute Postdoctorale Fellowship Award.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
