NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
complexos de proteína executar uma variedade de funções celulares cruciais. Elucidando suas interações e dinâmica não-covalentes é fundamental para a compreensão do papel dos complexos em sistemas biológicos. Embora a caracterização direta de conjuntos biomoleculares tornou-se cada vez mais importante nos últimos anos, técnicas de fraccionamento nativas que são compatíveis com técnicas de análise a jusante, incluindo espectrometria de massa, são necessárias para expandir ainda mais esses estudos. No entanto, o campo não tem um alto rendimento, ampla gama de alta recuperação método de separação para os conjuntos de proteínas nativas. Aqui, apresentamos clara fração líquida eluída-gel eletroforese aprisionamento nativo (CN-GELFrEE), que é uma nova modalidade de separação para os conjuntos de proteínas não-covalentes. desempenho de separação CN-GELFrEE foi demonstrada por complexos de fraccionamento extraídos do coração mouse. As fracções foram recolhidas ao longo de 2 h e exibida bandas discretas que variam de ~ 30 a 500 kDa. A confoi observado padrão sistente de aumentar a largura de banda de peso molecular, cada um variando ~ 100 kDa. Além disso, subsequente reanálise das fracções nativas através de SDS-PAGE mostrou peso molecular desloca consistente com a desnaturação de complexos de proteínas. Portanto, NC-GELFrEE foi provado oferecem a possibilidade de realizar de alta resolução e de alta recuperação separações nativas em complexos de proteína a partir de uma grande gama de pesos moleculares, proporcionando fracções que são compatíveis com as análises de proteínas a jusante.
Introduction
A maioria dos processos biológicos que acontecem dentro de uma célula são pensados para ser levada a cabo por conjuntos de proteínas, em vez de proteínas individuais 1. Por conseguinte, a fim de elucidar o papel biológico específico de uma subunidade de proteína numa célula é necessário para entender as suas interacções com outras proteínas estruturais ou ligandos em complexos de 2. No entanto, estudando proteínas nativamente, mantendo suas interações e atividade não-covalentes, continua sendo um desafio. Uma das deficiências dos estudos proteína nativa é uma técnica de separação nativa adequado que seja compatível com as várias técnicas de análise de proteína a jusante. Portanto, recente interesse em técnicas de separação, capazes de caracterizar os conjuntos não covalentes de biomoléculas aumentou acentuadamente 3.
técnicas de separação de proteínas são fundamentais para bioquímica, biofísica e vários outros estudos. técnicas de separação nativos atuais têm intrinsideficiências c que reduzem a compatibilidade com análises a jusante, tais como baixa resolução, baixa taxa de transferência, perda de precipitação, bem como a exigência de grandes quantidades de amostra inicial. Tandem purificação por afinidade é normalmente utilizada para estudos de interacção proteína, mas tem que ser levada a cabo separadamente para cada proteína alvo, fazendo com que seja incompatível com a análise de alto rendimento 4. Cromatografia de exclusão de tamanho 5, precipitação seletiva com cromatografia de afinidade de iões de 5 e densidade de gradiente de separação 6 todos têm fornecido separações nativos, mas são inerentemente técnicas de baixa resolução e requerem grandes quantidades iniciais de amostras.
Alternativamente, técnicas baseadas em gel, tais como azul nativo (BN) e Clear PAGE nativo (CN) (ou 1-D ou 2-D), apresentar separação de alta resolução. Além disso, em contraste com outras técnicas mencionadas, ambas as separações página native manter a solubilidade e conformação nativa de um r largaange de espécies de macromoléculas, incluindo as proteínas hidrofóbicas. Esse recurso amplia ainda mais a cobertura proteoma alcançado por estes métodos 7,8 e é conseguida através da química diferente entre CN e BN-PAGE. CN-PAGE comumente se baseia em detergentes suave cobrado como moléculas de transporte, substituindo o corante azul de Coomassie em BN-PAGE. BN-PAGE, embora associado com maior resolução, tem advertências, tais como redução da atividade enzimática nas proteínas separadas 8 e formação de aduto molécula de Coomassie, sendo este último muito prejudicial para MS jusante analisa 9. Ambos os métodos, no entanto, são tradicionalmente associados com baixa recuperação e cobertura proteoma estreita devido à coloração e limitações de extração de gel 7.
Para o estudo de proteínas desnaturadas, existem várias técnicas que manter a solubilidade macromolécula durante a execução de fraccionamento de alta resolução com elevada recuperação de proteína e que são compatíveis com diVerse técnicas de análise de proteína pós-separação. Gel que eluiu fracção líquida Armadilha de electroforese (GELFrEE) é uma das técnicas de fraccionamento que cabem todas estas características. Este método é amplamente aplicado em estudos de alto rendimento proteómica de cima para baixo, indicando que ele é rápido e versátil. Em GELFrEE, as proteínas são desnaturadas e separados com base no peso molecular por meio de uma matriz de gel tubular, a porosidade dos quais podem ser variadas com base em requisitos de amostra e os resultados desejados de fraccionamento. As fracções foram eluídas em fase líquida, reduzindo assim as limitações associadas com a recuperação de SDS-PAGE, mantendo alta resolução. Alíquotas fracção pode, então, ser analisado por um D-PAGE para-peso molecular selecção largura de banda 11. Há uma alta demanda para as vantagens associadas GELFrEE em técnicas de separação nativas. O método aqui descrito, claro nativo GELFrEE (NC-GELFrEE), é uma adaptação nativa de GELFrEE. A fim de ser compatível com uma ampla spectrum de macromoléculas no seu estado nativo, este método baseia-se não só na química suave NC-PAGE, mas também em uma separação por gradiente de porosidade, o que reduz a precipitação de proteína, eliminando a transição entre a dura porosidades presentes em sistemas de gel descontínuos 9. Quando aplicado a fraccionar complexos de proteínas extraídas a partir do coração de rato, fracções eluídas apresentado uma separação de alta resolução de uma ampla gama de pesos moleculares obtida foi elevada recuperação e. Além disso, as fracções resultantes são compatíveis com a maioria das análises bioquímicas e biofísicas da proteína a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
NC-GELFrEE é derivado a partir do sistema de tampão de PAGE nativa claro (CN) que utiliza uma mistura de detergentes aniónicos e neutros, como moléculas de transporte 9 para o fraccionamento de proteínas baseado no peso molecular, por meio de uma matriz de gel. A aplicação de CN-GELFrEE a um extrato de proteína de coração de rato nativo gerado frações de baixa complexidade com larguras de banda discreta, mantendo interações não covalentes de montagens biomoleculares. Comparação das…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O WM Keck Foundation generosamente forneceu o financiamento para este trabalho. Este material é baseado no trabalho apoiado pela FAPERJ bolsa de investigação 100,039 / 2014 do governo do Rio de Janeiro Estado – Brasil, para RDM, Ciência Sem Fronteiras bolsa 88888,075416 / 2013-00 da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, sob o governo do Brasil, por HSS, o National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o número comunhão 2014171659 para OSS, e pelo CNPq bolsa de investigação 202011 / 2012-7 do governo do Brasil para LHFDVPCH é um receptor de Química da vida de uma Universidade Northwestern Processos Instituto de Pós-Doutorado Fellowship Award.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
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