CN-GELFrEE - Native נקה ג'ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
קומפלקסי חלבונים לבצע המערה של תפקודים תאיים קריטיים. הבהרת הקישור לא קוולנטי שלהם ודינמיקה היא בעל חשיבות עליונה להבנת תפקידו של מתחמים במערכות ביולוגיות. בעוד האפיון הישיר של מכלולים וביומולקולרית הפך חשוב יותר ויותר בשנים האחרונות, טכניקות חלוקת יליד התואמות טכניקות ניתוח במורד זרם, כוללים ספקטרומטריית מסה, נחוצות כדי להרחיב עוד יותר את המחקרים הללו. עם זאת, השדה חסר שיטת הפרדת תפוקה גבוהה, רחבת היקף גבוהה התאוששות עבור מכלולי חלבון ילידים. כאן, אנו מציגים אלקטרופורזה מלכודת חלק נוזלי eluted ג'ל יליד ברורה (CN-GELFrEE), אשר היא שיטת הפרדת רומן אסיפות חלבון שאינו קוולנטיים. CN-GELFrEE ביצועי הפרדה הודגמו על ידי מתחמי פיצוח שחולצו מן לב עכבר. שברים נאספו מעל 2 hr ומוצגים להקות דיסקרטיות החל ~ 30 כדי 500 kDa. קוןדפוס עולה בקנה אחד של הגדלה רוחבי פס משקל מולקולרי נצפה, כל ~ 100 kDa מנעימים. יתר על כן, הניתוח מחדש הבא של שברי ילידים באמצעות SDS-PAGE הראה-משקל מולקולרי משמר בקנה אחד עם denaturation של קומפלקסי חלבונים. לכן, CN-GELFrEE הוכח להציע את היכולת לבצע הפרדות יליד ברזולוציה גבוהה גבוהה התאוששות על קומפלקסים חלבונים ממגוון משקל מולקולרי גדול, מתן שברים התואמות חלבון במורד הזרם מנתח.
Introduction
רוב התהליכים הביולוגיים קורה בתוך תא נחשבים להתבצע על ידי אסיפות חלבון ולא יחיד חלבונים 1. כתוצאה מכך, על מנת להבהיר את התפקיד ביולוגי הספציפי של למקטע חלבון בתא יש צורך להבין את יחסי הגומלין המבניים שלה עם חלבונים אחרים או הליגנדים מתחמים 2. עם זאת, לומדים חלבונים באופן מקורי, שמירת הקישור לא קוולנטי שלהם ופעילות, נותר מאתגר. אחד החסרונות של מחקרי חלבון יליד הוא טכניקת הפרדת יליד מתאימה התואמת טכניקות ניתוח חלבון במורד שונות. לכן, הריבית האחרונה טכניקות הפרדה מסוגלות מאפיינת מכלולים שאינם קוולנטיים של ביומולקולות גדלה 3 בחדות.
טכניקות הפרדת חלבון הם הכרח ביוכימיה, ביופיזיקה ומחקרים אחרים שונים. יש טכניקות הפרדת יליד נוכחיות intrinsiג ליקויים המפחיתים תאימות עם ניתוחים במורד זרם, כגון ברזולוציה נמוכה, תפוקה נמוכה, אובדן משקע, ואת הדרישה של כמויות גדולות של מדגם ראשוני. טיהור זיקת טנדם היא נפוצה ללימודי אינטראקצית חלבון, אבל זה חייבת להתבצע בנפרד לכל יעד חלבון, גורם לו להיות עולה בקנה אחד עם ניתוח תפוקה גבוהה 4. גודל דרה כרומטוגרפיה 5, ממטרים סלקטיבית עם זיקת יון כרומטוגרפיה 5 וצפיפות-שיפוע הפרדה 6 כל ספקו פרדות ילידים, אבל מטבעם טכניקות ברזולוציה נמוכה ודורשות כמויות מדגם ראשוניות גבוהות.
לחלופין, טכניקות מבוססות ג'ל, כגון כחול שפת אם (BN) ונקה שפת אם (CN) עמוד (או 1-D או 2-D), להציג ההפרדה ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, בניגוד טכניקות אחרות כאמור, הן הפרדות עמוד הילידים לשמור מסיסות קונפורמציה הילידים של r רחבange של מינים מקרומולקולה, כולל חלבונים הידרופובי. יכולת זו עוד מרחיב את הכיסוי proteome הגיע בשיטות אלה 7,8 ו מושגת באמצעות כימיה שונה בין CN ו-PAGE BN. CN-העמוד מסתמך בדרך כלל על חומרי ניקוי רך טעונים כמולקולות מובילות, החלפת צבע Coomassie הכחול-עמוד BN. BN-PAGE, למרות הקשורים ברזולוציה גבוהה יותר, יש אזהרות כגון פעילות האנזימטית מופחתת של חלבונים המופרדים 8 והיווצרות adduct Coomassie מולקולה, שהאחרון קדום רב במורד MS מנתח 9. שתי השיטות הללו, עם זאת, קשורות באופן מסורתי עם התאוששות נמוכה וכיסוי proteome צר עקב מכתים ומגבלות מיצוי ג'ל 7.
לצורך המחקר של חלבונים מפוגלים, ישנן טכניקות כמה מקיימות מסיסות מקרומולקולה בעת ביצוע חלוק ברזולוציה גבוהה עם התאוששות חלבון גבוה התואמות דiverse טכניקות ניתוח חלבון שלאחר ההפרדה. ג'ל eluted נוזלי הפרקציה מילכוד אלקטרופורזה (GELFrEE) היא אחת הטכניקות החלוקות שמתאימות לכל המאפיינים הללו. שיטה זו מיושמת בעיקר במחקרים פרוטאומיקה תפוקה גבוהה מלמעלה למטה, המציין שזה מהיר צדדי. בשנת GELFrEE, חלבונים הם מפוגלים והפרידו מבוססים על משקל מולקולרי באמצעות מטריצת ג'ל צינורי, הנקבובי של אשר ניתן לשנות על פי דרישות מדגם והתוצאות החלוקות הרצויות. שברים הם eluted בשלב נוזל, ובכך להקטין את המגבלות לשחזור משויכות SDS-PAGE, תוך שמירה ברזולוציה גבוהה. Aliquots שבר לאחר מכן ניתן לנתח על ידי עמוד 1-D לבחירת רוחב פס בעל משקל מולקולרי 11. קיים ביקוש גבוה עבור היתרונות הקשורים GELFrEE בטכניקות הפרדה הילידים. השיטה המתוארת במסמך זה, נקה Native GELFrEE (CN-GELFrEE), הוא עיבוד יליד GELFrEE. כדי להיות תואם עם ים רחבpectrum של מקרומולקולות במצב הטבעי שלהם, שיטה זו נשענת לא רק על כימית CN-העמוד הרך, אלא גם על פרדת שיפוע נקבובי, אשר מפחיתה משקעי חלבון על ידי ביטול המעבר הקשה בין porosities הנוכחי במערכות ג'ל רציפות 9. כאשר מוחלים fractionate קומפלקסי חלבונים המופקים לב עכבר, שברי eluted מוצגים התאוששות גבוהה הפרדה גבוהה ברזולוציה של מגוון רחב של משקלות מולקולריים הושגה. יתר על כן, שברים הנובעים תואמים ביותר חלבון ביוכימיות biophysical במורד הזרם מנתח.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE נגזר יליד ברור (CN) מערכת חיץ עמוד המשתמשת תערובת של anionic ודטרגנטים ניטראלי כמולקולות מובילות 9 עבור חלוקת חלבון בעל משקל מולקולרי מבוססת באמצעות מטריקס ג'ל. היישום של CN-GELFrEE כדי לחלץ חלבון לב עכבר יליד שנוצר שברים מורכבים נמוכים עם רוחבי פס דיסקרטי תוך שמ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קק קרן סיפקה מימון בנדיבות עבור עבודה זו. חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי מענק מחקר FAPERJ 100.039 / 2014 מהממשלה של ריו דה ז'נרו מדינה – ברזיל עבור RDM, מדע בלי מלגת גבולות 88888.075416 / 2013-00 מן לתיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה, תחת הממשלה של ברזיל, עבור HSS, את מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע תחת מספר המילגה 2014171659 עבור OSS, ועל ידי מענק מחקר CNPq 202,011 / 2012-7 מממשלת ברזיל עבור LHFDVPCH הוא הנמען של כימיה של החיים של אוניברסיטת Northwestern תהליכים מכון דוקטורים אחוות פרס.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
