सीएन GELFrEE - साफ़ देशी जेल-eluted तरल अंश फंसाने वैद्युतकणसंचलन
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
प्रोटीन परिसरों महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों की एक सरणी प्रदर्शन करते हैं। उनकी गैर सहसंयोजक बातचीत और गतिशीलता elucidating जैविक प्रणालियों में परिसरों की भूमिका को समझने के लिए सर्वोपरि है। biomolecular विधानसभाओं के प्रत्यक्ष लक्षण वर्णन हाल के वर्षों में तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है, मूल निवासी विभाजन तकनीक है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित बहाव के विश्लेषण तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं, आगे इन अध्ययनों का विस्तार करने के लिए आवश्यक हैं। फिर भी, क्षेत्र एक उच्च throughput, व्यापक रेंज, उच्च वसूली जुदाई मूल निवासी प्रोटीन विधानसभाओं के लिए विधि का अभाव है। यहाँ, हम स्पष्ट देशी जेल-eluted तरल अंश फंसाने वैद्युतकणसंचलन (सीएन GELFrEE) है, जो गैर-सहसंयोजक प्रोटीन विधानसभाओं के लिए एक उपन्यास जुदाई साधन है प्रस्तुत करते हैं। सीएन GELFrEE जुदाई प्रदर्शन माउस दिल से निकाला fractionating परिसरों द्वारा प्रदर्शन किया गया। भिन्न 2 घंटा से अधिक एकत्र और असतत ~ 30 से 500 केडीए को लेकर बैंड प्रदर्शित किए गए। एक चोरआणविक वजन बैंडविड्थ बढ़ाने की sistent पैटर्न मनाया गया, प्रत्येक लेकर ~ 100 केडीए। इसके अलावा, एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से मूल निवासी अंशों के बाद के पुनर्विश्लेषण आणविक वजन प्रोटीन परिसरों का विकृतीकरण के साथ लगातार बदलाव से पता चला है। इसलिए, सीएन GELFrEE, एक बड़ी आणविक वजन सीमा से प्रोटीन परिसरों पर उच्च संकल्प और उच्च वसूली मूल निवासी विभाजन प्रदर्शन करने की क्षमता की पेशकश करने अंशों कि बहाव प्रोटीन का विश्लेषण करती है के साथ संगत कर रहे हैं प्रदान कर साबित कर दिया था।
Introduction
एक कोशिका के भीतर हो रहा जैविक प्रक्रियाओं के बहुमत के एक प्रोटीन 1 प्रोटीन विधानसभाओं के बजाय द्वारा किया जा करने के लिए लगा रहे हैं। नतीजतन, क्रम में एक सेल में एक प्रोटीन सबयूनिट के विशिष्ट जैविक भूमिका को स्पष्ट करने के लिए यह परिसरों में 2 अन्य प्रोटीन या ligands के साथ अपनी संरचनात्मक बातचीत को समझने के लिए आवश्यक है। हालांकि, प्रोटीन natively का अध्ययन, उनके गैर सहसंयोजक बातचीत और गतिविधि को बनाए रखने, चुनौती बनी हुई है। मूल निवासी प्रोटीन के अध्ययन की कमियों में से एक एक उपयुक्त मूल निवासी जुदाई तकनीक है कि विभिन्न डाउनस्ट्रीम प्रोटीन विश्लेषण तकनीक के साथ संगत है। इसलिए, जुदाई biomolecules के गैर-सहसंयोजक विधानसभाओं निस्र्पक में सक्षम तकनीक में हाल ही में ब्याज तेजी से 3 बढ़ गई है।
प्रोटीन जुदाई तकनीक जैव रसायन, बायोफिज़िक्स और विभिन्न अन्य अध्ययन के लिए जरूरी हैं। वर्तमान मूल निवासी जुदाई तकनीक intrinsi हैसी कमी है कि इस तरह के कम संकल्प, कम throughput, वर्षा के लिए हानि, और प्रारंभिक नमूना की बड़ी मात्रा की आवश्यकता के रूप में नीचे की ओर विश्लेषण, साथ अनुकूलता को कम। मिलकर आत्मीयता शुद्धि सामान्यतः प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह प्रत्येक प्रोटीन लक्ष्य के लिए अलग से बाहर ले जाने के लिए यह उच्च throughput विश्लेषण 4 के साथ असंगत होने के कारण है। आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी 5, आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी 5 और घनत्व-ढाल जुदाई 6 सभी देशी विभाजन प्रदान की है, लेकिन स्वाभाविक कम संकल्प तकनीक रहे हैं और उच्च प्रारंभिक नमूना मात्रा की आवश्यकता के साथ चयनात्मक वर्षा।
वैकल्पिक रूप से, इस तरह के मूल निवासी ब्लू (बी एन) और साफ़ मूल निवासी (सीएन) पेज के रूप में जेल आधारित तकनीक, (या तो 1-डी या 2 डी), उच्च संकल्प जुदाई प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, के साथ अन्य तकनीकों का उल्लेख विषम, दोनों देशी पृष्ठ विभाजन घुलनशीलता और एक व्यापक आर के मूल निवासी रचना को बनाए रखने केहाइड्रोफोबिक प्रोटीन सहित macromolecule प्रजातियों की Ange। यह क्षमता आगे proteome कवरेज इन तरीकों 7.8 से पहुंचा broadens और सीएन और बी एन-पृष्ठ के बीच अलग-अलग रसायन विज्ञान के माध्यम से हासिल की है। सीएन पृष्ठ आमतौर पर वाहक अणुओं के रूप में मुलायम का आरोप लगाया डिटर्जेंट, बीएन पृष्ठ में Coomassie ब्लू डाई की जगह पर निर्भर करता है। बीएन पृष्ठ, हालांकि उच्च संकल्प के साथ जुड़े, इस तरह के अलग प्रोटीन 8 और Coomassie अणु अभिवर्तन गठन में कम enzymatic गतिविधि, बाद में काफी नीचे की ओर एमएस के प्रतिकूल होने के नाते विश्लेषण 9 के रूप में निरंतर है। इन दोनों विधियों, हालांकि, पारंपरिक रूप से कम वसूली और धुंधला हो जाना और जेल निकालना सीमाओं 7 के कारण संकीर्ण proteome कवरेज के साथ जुड़े रहे हैं।
विकृत प्रोटीन के अध्ययन के लिए, वहाँ कई तकनीकों है कि macromolecule घुलनशीलता बनाए रखने, जबकि उच्च प्रोटीन वसूली के साथ उच्च संकल्प विभाजन प्रदर्शन कर रहे हैं और कहा कि डी के साथ संगत कर रहे हैंपोस्ट-जुदाई प्रोटीन विश्लेषण तकनीक iverse। जेल eluted तरल अंश फंसाने इलेक्ट्रोफ़ोरेसिस (GELFrEE) विभाजन तकनीक है कि इन सभी विशेषताओं फिट में से एक है। इस विधि को काफी हद तक उच्च throughput ऊपर से नीचे प्रोटिओमिक्स अध्ययन में लागू किया जाता है, यह दर्शाता है कि यह तेजी से और बहुमुखी है। GELFrEE, प्रोटीन विकृत कर रहे हैं और एक ट्यूबलर जेल मैट्रिक्स के माध्यम से आणविक वजन के आधार पर अलग हो गए, जिनमें से porosity नमूना आवश्यकताओं और वांछित परिणाम के आधार पर विभाजन अलग किया जा सकता है। भिन्न तरल चरण में eluted हैं, इस प्रकार है, जबकि उच्च संकल्प को बनाए रखने के एसडीएस पृष्ठ के साथ जुड़े वसूली सीमाओं को कम करने। अंश aliquots तो आणविक वजन बैंडविड्थ चयन 11 के लिए 1-डी पृष्ठ से विश्लेषण किया जा सकता है। वहाँ के मूल निवासी जुदाई तकनीक में GELFrEE से जुड़े फायदे के लिए उच्च मांग है। विधि यहाँ बताया, साफ़ मूल निवासी GELFrEE (सीएन-GELFrEE), GELFrEE के एक निवासी रूपांतर है। आदेश में एक व्यापक एस के साथ संगत होना करने के लिएउनके पैतृक राज्य में बड़े अणुओं की pectrum, इस विधि से न केवल मुलायम सीएन पृष्ठ रसायन विज्ञान पर, लेकिन यह भी एक porosity ढाल जुदाई, जो असंतत जेल सिस्टम 9 में मौजूद porosities के बीच कठोर संक्रमण को नष्ट करने से प्रोटीन वर्षा कम कर देता है पर निर्भर करता है। जब माउस दिल से निकाले गए प्रोटीन परिसरों fractionate के लिए आवेदन किया, eluted अंशों उच्च वसूली और आणविक वजन की एक विस्तृत श्रृंखला के एक उच्च संकल्प जुदाई प्राप्त हुई थी दिखाया गया है। इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप अंशों सबसे नीचे की ओर जैव रासायनिक और biophysical प्रोटीन का विश्लेषण करती है के साथ संगत कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएन GELFrEE स्पष्ट मूल निवासी (सीएन) पृष्ठ बफर सिस्टम एक जेल मैट्रिक्स के माध्यम से आणविक वजन आधारित प्रोटीन विभाजन के लिए वाहक अणुओं 9 के रूप में ऋणात्मक और तटस्थ डिटर्जेंट का एक मिश्रण का उपयोग करता ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WM उबकना फाउंडेशन उदारता से इस काम के लिए धन प्रदान किया। इस सामग्री को काम FAPERJ शोध अनुदान १००.०३९ / 2014 से रियो डी जनेरियो राज्य की सरकार से समर्थन पर आधारित है – उच्च शिक्षा में सुधार के लिए कार्मिक समन्वय से बॉर्डर्स छात्रवृत्ति ८८,८८८.०७५४१६ / 2,013-00 बिना आरडीएम के लिए ब्राजील, विज्ञान सरकार के तहत, ब्राजील की, एचएसएस के लिए, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप के लिए ओ.एस.एस. नंबर 2014171659 के तहत फैलोशिप, और CNPq शोध अनुदान LHFDVPCH के लिए ब्राजील की सरकार की ओर से 202,011 / 2012-7 से जीवन का एक नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय के रसायन विज्ञान के एक प्राप्तकर्ता प्रक्रियाओं संस्थान Postdoctoral है फैलोशिप अवार्ड।
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
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