DamID-след: Генома Отображение белок-ДНК взаимодействий с высокой пропускной секвенирования аденина-метилированных фрагментов ДНК
Summary
Мы здесь, в описания анализа путем сочетания идентификации ДНК аденин метилтрансферазы (DamID) для высокой пропускной последовательности (DamID-след). Этот усовершенствованный способ обеспечивает более высокое разрешение и широкий динамический диапазон и позволяет анализировать DamID-SEQ данные в сочетании с другими данными секвенирования с высокой пропускной способностью, таких как чип-SEQ, РНК-SEQ и т.д.
Abstract
The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.
Introduction
ДНК метилтрансферазы идентификация аденин (DamID) 1,2 является метод обнаружения взаимодействий белок-ДНК в естественных условиях и является альтернативным подходом к иммунопреципитации хроматина (чип) 3. Он использует относительно небольшое количество клеток и не требует химической сшивки белка с ДНК или очень специфических антител. Последнее особенно полезно, когда целевой белок слабо или косвенно связаны с ДНК. DamID успешно используется для отображения сайты связывания различных белков, включая ядерное белков оболочки 4-10, хроматина белков, ассоциированных с 11-13, хроматина изменения ферменты 14, транскрипционных факторов и сопутствующих факторов и РНК-интерференции 15-18 механизмов 19. Метод применим в различных организмов, включая S. Cerevisiae 13, С. pombe 7, С. Элеганс 9,17, Д. MELANOGASTER 5,11,18,20, А. THALIANA 21,22, а также мыши и человека клеточных линий 6,8,10,23,24.
Разработка анализа DamID была основана на специфической детекции аденина-метилированных фрагментов ДНК в эукариотических клетках, которые не имеют эндогенной аденин метилирование 2. Выраженный слитый белок, состоящий из ДНК-связывающего белка, представляющего интерес и Е. палочка ДНК аденин метилтрансферазы (плотины), может метилировать аденин базу в последовательности GATC, которые находятся в пространственной близости (наиболее значительно в течение 1 кб и до примерно 5 кб) сайтов связывания белка в геноме 2. Модифицированные ДНК-фрагменты могут быть специфично амплифицируют и гибридизуют с микрочипов для выявления геномных сайтов связывания белка, представляющего интерес 1,25,26. Это оригинальный способ DamID был ограничен наличием микрочипов и плотности заданных зондов. Поэтому мы интегрировали высокой пропускной последовательности вчтобы DamID 10 и обозначены метод как DamID-SEQ. Большое количество краткосрочных читает полученные от DamID-SEQ позволяет точную локализацию взаимодействий белок-ДНК генома. Мы обнаружили, что DamID-след обеспечил более высокое разрешение и более широкий динамический диапазон, чем DamID по микрочипов для изучения генома ядерной пластинки (NL) ассоциации 10. Это усовершенствованный метод позволяет зондирования NL ассоциации в пределах гена структур 10 и облегчает сравнение с другими данными секвенирования высокой пропускной способностью, таких как чип-SEQ и РНК-SEQ.
DamID-след протокол, описанный здесь был первоначально разработан для отображения генома Л. объединений 10. Мы создали гибридный белок по привязывая мыши или человека Ламин B1 Е. палочка ДНК аденин метилтрансферазы и проходят протокол в 3T3 эмбриональных фибробластов мыши, мыши C2C12 миобластов 10 и IMR90 плода фибробласты легких человека (данные не опубликованы). В этом протоколе, мы начинаем с сonstructing векторы и выражая Дам-привязанных слитые белки от лентивирусного инфекции в клетках млекопитающих 24. Далее, мы опишем подробные протоколы усиления аденин-метилированных фрагментов ДНК и подготовке секвенирования библиотек, которые должны быть применимы в других организмах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Whether Dam-tagged proteins retain the functions of endogenous proteins should be examined before a DamID-seq experiment. The subcellular localization of Dam-tagged nuclear envelope proteins should always be determined and compared with that of the endogenous proteins. For studying transcription factors, it is suggested to examine whether the Dam-fusion protein can rescue the functions of the endogenous protein in regulating gene expression. This functional test can be performed in organisms in which knockout mutants of …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Bas van Steensel for providing the DamID mammalian expression vectors. We thank Yale Center for Genome Analysis and the Genomics Core in Yale Stem Cell Center for advice on preparing NGS libraries and implementing high throughput DNA sequencing. This work was supported by the startup funding from Yale School of Medicine, a Scientist Development Grant from American Heart Association (12SDG11630031) and a Seed Grant from Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).
Materials
| ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
| Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
| 293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
| Tris | brand not critical | ||
| EDTA | brand not critical | ||
| 200 Proof EtOH | brand not critical | ||
| Isopropanol | brand not critical | ||
| Sodium Acetate | brand not critical | ||
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
| DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
| T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
| DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
| DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
| 1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
| MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
| SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
| T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
| Klenow Fragment (3’ -> 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
| sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 11.2; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
| sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
| KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5X KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10mM dNTP mix |
| agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
| ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
| Spectrophotometer | brand not critical | ||
| 0.45 um PVDF Filter | brand not critical | ||
| 25 ml Seringe | brand not critical | ||
| 10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
| 6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
| Vortex Mixer | brand not critical | ||
| Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
| Microcentrifuge | brand not critical | ||
| Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
| Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
| UV transilluminator | brand not critical | ||
| E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |
References
- van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
- van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
- Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
- Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
- Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
- Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
- Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
- Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
- Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21 (2014).
- Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591 (2013).
- Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
- Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
- Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028 (2013).
- Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
- Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
- Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399 (2010).
- Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178 (2004).
- Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
- Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
- Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
- Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
- Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
- Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
- de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
- . Illumina TruSeq adaptors & PCR primers Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015)
- . Optimization of PCR cycles for NGS Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015)
- Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
- Encode Project Consortium. A user’s guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046 (2011).
- Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
- Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110 (2014).
- Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452 (2014).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
- Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
- Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).
