زراعة الخلايا الأولية الأديم الباطن طلائي من الكيس المحي غشاء اليابانية السمان الأجنة
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
أنشأنا الظهارية نموذج خلية ثقافة الأديم الباطن (EEC) لدراسة وظيفة بعض الأنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام المواد الغذائية التي أجنة الطيور خلال التنمية. وحضنت المخصبة بيض السمان اليابانية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام ثم صفار جمعت أغشية الكيس (YSM) لإنشاء نظام ثقافة الجماعة الاقتصادية الأوروبية. نحن عزل طبقة الأديم الجنينية من YSM، وشرائح الغشاء إلى 2-3 قطع ملم ويهضم جزئيا مع كولاجيناز قبل البذر في لوحات ثقافة 24-جيدا. وEECS تتكاثر من النسيج ونحن على استعداد للدراسات ثقافة الخلية. وجدنا أن EECS كان الخصائص المميزة للYSM في الجسم الحي، على سبيل المثال، وتراكم قطرات الدهون، تعبيرا عن ستيرول O-ناقلة الأسيل والليباز البروتين الدهني. علاج الهضم جزئية زيادة كبيرة في معدل نجاح ثقافة السوق الأوروبية المشتركة. الاستفادة من EECS، أثبتنا أن التعبير عن SOAT1 ينظمها المخيم دبروتين كيناز ependent مسارا ذات الصلة. هذا النظام الثقافة السمان EEC الياباني الأساسي هو أداة مفيدة لدراسة نقل الدهون الجنينية وتوضيح دور الجينات المسؤولة في التوسط في استخدام المواد الغذائية في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور.
Introduction
المورد الغذائي الرئيسي للجنين الطيور هو صفار البيض، ويتألف من 33٪ والدهون، والبروتين 17٪، و 1٪ رماد. 1 أثناء التطور الجنيني، غشاء الكيس المحي (YSM) ينمو من داخل تجويف البطن الجنينية ويغطي تدريجيا صفار البيض سطح. ابتداء من اليوم الجنينية 2، يتم زيادة التعبير الجيني المرتبط التمثيل الغذائي للدهون والأوعية الدموية تدريجيا في YSM، وYSM يتطور ببطء التوقعات مثل الزغب. 8،9 هذه التوقعات زيادة امتصاص المواد الغذائية صفار البيض لدعم التطور الجنيني. وYSM هو الأنسجة خارج الجنين الذي يحتوي على ثلاث طبقات جرثومية، الأديم، الأديم المتوسط والأديم الظاهر 14 في الأديم الظاهر الكيس المحي يواجه زلال والروابط مع الغشاء المحي لتغطية بلطف الكيس المحي. وتواجه الخلايا الظهارية الأديم الباطن مباشرة نحو صفار البيض وتكون بمثابة بوابات استخدام المغذيات. 6 ويوسع YSM، الخلايا الظهارية الأديم الباطن (EECS) يمكن تقسيمها من حالات العسر الشديده وظيفة إلى مجموعتين، منطقة المحي والوعائية للمنطقة. 7
وتتكون منطقة المحي من خلايا الأديم الباطن وغير بعيد من الجنين. وتتكون منطقة وعائية من خلايا أرومية متوسطة ويغطي EECS متباينة مع الأوعية الدموية والأنسجة الضامة. بعد يوم الجنينية 5، وتغطي صفار البيض تماما من الأديم الظاهر والأديم الباطن من YSM ومنطقة الأوعية الدموية قد نمت بسرعة. وYSM تمتص، recomposes والنشرات الدهون (كما الصفار المستمدة منخفضة جدا كثافة البروتين الدهني) والبروتينات في نظام الدورة الدموية الجنينية. 9، 2 لذلك، أنشأنا السمان الجنينية النظام الياباني الأساسي الأديم الباطن الظهارية زراعة الخلايا، لدراسة آليات الدهون استخدام في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور.
الدهون مثل الدهون الثلاثية، ليستين، فوسفورية واستر الكولسترول (CE) هي مصادر الطاقة الأولية للأجنة الطيور. في المراحل المبكرة من التطور، والدهون صفار هي جomposed من 1.3٪ فقط م، وترتفع إلى 10-15٪ في منتصف المدة من التطور الجنيني الطيور 3، ويتم تصنيع 11. استر الكولسترول من الكولسترول بنسبة ستيرول O-ناقلة الأسيل 1 (SOAT1) في YSM جنين الطيور. 4
شكل تخزين الكوليسترول هو CE، ويتم CE في البروتينات الدهنية، ويتم نقل البروتينات الدهنية بواسطة الدورة الدموية إلى الأنسجة. 13 وقبل أسبوع يفقس هناك نمو السريع للأجنة الطيور. تقريبا يتم امتصاص 68٪ من محتويات الدهون المتبقية في صفار خلال هذه المرحلة. 10 الآلية التي صفار وتستخدم الدهون يمكن توضيحها من خلال نموذج البحث EEC. وتم إنشاء بروتوكول ثقافة EEC الدجاج لتحقيق هذا الهدف البحوث. 2، 9 ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى انخفاض معدل النجاح من إإكسبلنتس الأنسجة، هناك حاجة إلى تحسين إجراءات زراعة الخلايا الجماعة الاقتصادية الأوروبية لدراسة وظيفة بعض الأنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام المواد الغذائية من قبل أجنة الطيور خلال التنمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لأن النظام الثقافة السابق سوى نجاح محدود، هناك حاجة إلى نظام ثقافة أفضل. اليابانية الأديم السمان YSM يتطلب العلاج مع الإنزيمات المحللة للبروتين مثل كولاجيناز لتخفيف تقاطعات خلية خلية لتحقيق أداء أفضل نمو في إإكسبلنتس فيفو السابقين. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم التمويل لتطوير البروتوكول الحالي بشكل خاص "الهدف لخطة جامعة أعلى" من جامعة تايوان الوطنية، تايوان (منحة ID-104R350144)، وكذلك وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (ID المنحة: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). نخص بالشكر مركز للتكنولوجيا الحيوية من جامعة تايوان الوطنية لتوفير غرفة الحيوان والفضاء مختبر لدراسة الحالية.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- . . alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
