Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Nous avons établi un modèle épithélial de culture de cellules endodermiques (CEE) pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l'utilisation des nutriments par les embryons aviaires au cours du développement. Fécondés oeufs de caille japonaise ont été incubées à 37 ° C pendant 5 jours, puis jaunes d'membranes sac (YSM) ont été collectées pour établir le système de culture CEE. Nous avons isolé la couche endoderme embryonnaire de YSM et tranché la membrane en 2 – 3 pièces mm et partiellement digéré avec de la collagénase avant le semis dans des plaques de culture de 24 puits. Les CPE prolifèrent sur le tissu et sont prêts pour les études de culture cellulaire. Nous avons constaté que les CPE a des caractéristiques typiques de YSM in vivo, par exemple, l' accumulation de gouttelettes lipidiques, l' expression de la stérol O-acyltransférase et la lipoprotéine lipase. Le traitement de la digestion partielle a augmenté de manière significative le taux de réussite de la culture CEE. Utilisant les CPE, nous avons démontré que l'expression de SOAT1 a été réglementé par le AMPc dla protéine kinase A ependent voie connexe. Ce système de culture caille japonaise CEE primaire est un outil utile pour étudier le transport des lipides embryonnaire et de clarifier le rôle des gènes impliqués dans la médiation de l'utilisation des nutriments dans YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.
Introduction
La ressource nutritive majeure de l'embryon aviaire est le jaune, composé de 33% de lipides, 17% de protéines et 1% de cendres. 1 Au cours du développement embryonnaire, la membrane de la vésicule ombilicale (YSM) croît de l' intérieur de la cavité abdominale de l' embryon et recouvre progressivement le jaune d' oeuf surface. Commençant à jour embryonnaire 2, l' expression des gènes associés au métabolisme des lipides et de l' angiogenèse est progressivement augmentée en YSM et le YSM développe lentement projections villosités-like. 8,9 Ces projections augmentent l' absorption des nutriments de jaune pour soutenir le développement embryonnaire. Le YSM est un tissu extra – embryonnaire qui contient trois couches germinales, endoderme, mésoderme et ectoderme. 14 L'ectoderme jaune sac fait face à l'albumen et des liens avec la membrane vitelline pour couvrir délicatement le sac jaune. Les cellules épithéliales endodermiques sont confrontés directement vers le jaune d'œuf et servent de portails d'utilisation des éléments nutritifs. 6 Comme étend la YSM, endodermique cellules épithéliales (CPE) peut être divisé par shape et la fonctionnalité en deux groupes, zone vitellines et la zone vasculosa. 7
Zone vitelline est composé de cellules endodermiques et est éloigné de l'embryon; zone vasculosa est composé de cellules mésodermiques et couvre les CPE différenciées avec les vaisseaux sanguins et les tissus conjonctifs. Par jour embryonnaire 5, le jaune est totalement couvert par l'ectoderme et l'endoderme de YSM et la région vasculaire a connu une croissance rapide. La YSM absorbe, recompose et libère les lipides (comme le jaune dérivé très lipoprotéines de basse densité) et des protéines dans le système circulatoire embryonnaire. 9, 2 Par conséquent, nous avons mis en place un système primaire japonais de caille embryonnaire endodermique épithéliales de culture cellulaire, pour étudier les mécanismes de lipides l'utilisation en YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.
Lipides tels que les triacylglycérols, de la lécithine, un phospholipide et un ester de cholestérol (EC) sont les principales sources d'énergie pour les embryons aviaires. Aux premiers stades de leur développement, les lipides du jaune sont composed de seulement 1,3% CE et il monte à 10-15% à mi-parcours du développement embryonnaire aviaire 3, 11 ester de cholestérol. est synthétisée à partir du cholestérol par stérol O-acyltransférase 1 (SOAT1) dans aviaire embryon YSM. 4
La forme de stockage du cholestérol est CE, C'est effectuée dans les lipoprotéines, et les lipoprotéines sont transportées par la circulation vers les tissus. 13 Une semaine avant l' éclosion il y a une croissance rapide des embryons d' oiseaux. Environ 68% du contenu en lipides restant dans le jaune sont absorbés au cours de cette étape. 10 Le mécanisme par lequel les lipides sont utilisés jaune d' oeuf peut être clarifiée par un modèle de recherche CEE. Un protocole de culture CEE du poulet a été mis en place pour atteindre cet objectif de recherche. 2, 9 Toutefois, en raison du faible taux de réussite des explants de tissus, une procédure de culture cellulaire CEE améliorée est nécessaire pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l' utilisation des nutriments par embryons d'oiseaux au cours du développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parce que le système de culture précédente a qu'un succès limité, un meilleur système de culture est nécessaire. La caille YSM endoderme japonaise nécessite un traitement avec des enzymes protéolytiques telles que la collagénase pour desserrer les jonctions cellule-cellule pour obtenir une meilleure performance de la croissance dans les explants ex-vivo. Nos données montrent que le nombre de cellules provenant du traitement de digestion partielle ont été supérieures à partir de la culture de tissu non…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement pour le développement du protocole actuel est particulièrement soutenue par "But du Plan Université Top" de l'Université nationale de Taiwan, Taiwan (subvention ID-104R350144), ainsi que le Ministère de la science et de la technologie de Taiwan (subvention ID: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Nous remercions tout particulièrement le Centre de biotechnologie de l'Université nationale de Taiwan pour fournir une salle d'animaux et de l'espace de laboratoire pour l'étude en cours.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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