הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
הקמנו מודל תרבית תאים endodermal אפיתל (EEC) ללימוד פונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי העופות במהלך הפיתוח. ביצי שליו יפניות מופרות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים ולאחר מכן חלמון ממברנות צק (YSM) נאספו להקים מערכת התרבות EEC. בודדנו את שכבת endoderm העוברית YSM, וחתכתי את הממברנה לתוך 2 – 3 חתיכות מ"מ ו מעוכל חלקית עם collagenase לפני זריעת צלחות תרבות 24 גם. EECS להתרבות מתוך הרקמה והם מוכנים ללימודי תרבית תאים. מצאנו כי EECS היו מאפיינים טיפוסיים של YSM in vivo, למשל, הצטברות של טיפות השומנים, ביטוי sterol O-acyltransferase וטריפז השומנים בדם. טיפול עיכול חלקי גדיל משמעותי את השיעור המוצלח של תרבות EEC. ניצול EECS, הראינו כי הביטוי של SOAT1 הוסדר על ידי ד cAMPחלבון ependent kinase מסלול רציף קשור. מערכת תרבות EEC שליו היפנית העיקרית זהו כלים שימושיים ללמוד תחבורת שומנים עוברית להבהיר את התפקיד של גני המעורבים בתיווך ניצול מזין YSM במהלך התפתחות עוברית עופות.
Introduction
המשאב התזונתי העיקרי של עובר העופות הוא חלמון, מורכב 33 שומני%, 17% חלבון, ו -1% אפר. 1 במהלך התפתחות עוברית, קרום צק חלמון (YSM) גדל מתוך חלל הבטן העוברי ובהדרגה מכסה את החלמון משטח. החל ביום עוברי 2, ביטוי גנים הקשורים לחילוף חומרי אנגיוגנזה שומנים הוא גדל בהדרגת YSM, ואת YSM מתפתחת לאט תחזיות סיסיות דמויות. 8,9 תחזיות אלו להגדיל ספיגת מזון בגוף חלמון לתמוך התפתחות עוברית. YSM הוא רקמת extraembryonic המכיל שלוש שכבות הנבט, האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם. 14 האאקטודרם שק חלמון פונה חלבון וקישורים עם קרום vitelline כדי לכסות את שק החלמון בעדינות. לתאי האפיתל endodermal מתמודדים ישירות לעבר חלמון ביצה ולשמש פורטלים ניצול מזין. 6 ככל YSM מתרחב, תא אפיתל endodermal (EECS) ניתן לחלק ידי shapדואר ופונקציונלי לשתי קבוצות, vitelline האזור והאזור vasculosa. 7
vitelline פינת מורכב של תאים endodermal והוא רחוק מן העובר; vasculosa באזור מורכב של תאי mesodermal ומכסה EECS בדיל עם כלי דם ורקמות חיבור. על ידי עוברי יום 5, החלמון מכוסה לחלוטין על ידי האאקטודרם ו endoderm של YSM ואזור וסקולרית גדל בקצב מהיר. YSM סופג, גורם לבנייה מחדש ומשחרר שומנים (כמו החלמון נגזר ליפופרוטאין בצפיפות נמוך מאוד) וחלבונים לתוך מערכת הדם העוברית. 9, 2 לכן, הקימו מערכת תרבית תאי אפיתל endodermal עוברית שליו יפנית עיקרית, כדי לחקור את המנגנונים של שומנים הנצילות YSM במהלך ההתפתחות העוברית העופות.
ליפידים כגון triacylglycerol, לציטין, פוספוליפידים ואסתר כולסטרול (CE) הם מקורות האנרגיה העיקריים עוברות עופות. בשלבים המוקדמים של פיתוח, שומני חלמון הם גomposed של CE 1.3% בלבד והוא עולה ל 10-15% ב אמצע הקדנציה של פיתוח 3 עובריים העופות, 11. אסתר כולסטרול הוא מסונתז מכולסטרול על ידי 1-acyltransferase O sterol (SOAT1) ב YSM העובר העופות. 4
צורת האחסון של כולסטרול היא CE, CE מתבצעת ליפופרוטאינים, ו ליפופרוטאינים מועברים על ידי מחזור דם לרקמות. 13 שבוע לפני הצוהר יש צמיחה מהירה של עוברי עופות. כ -68% מתוכן השומנים שנותר חלמון נספגים בשלב זה. 10 המנגנון שבאמצעותו חלמון שומנים מנוצלים ניתן לברר באמצעות מודל מחקר EEC. פרוטוקול תרבות עוף EEC הוקם כדי להשיג את מטרה במחקר זה. 2, 9 עם זאת, עקב שיעור ההצלחה הנמוך של explants רקמות, הליך תרבית תאים משופר EEC נדרש כדי ללמוד את הפונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי עופות במהלך פיתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
כיוון שמערכת התרבות הקודמת יש הצלחה מוגבלת בלבד, מערכת התרבות טוב יותר הוא זקוק. Endoderm YSM שליו יפני נזקק לטיפול אנזימים מפרקי חלבונים כגון collagenase כדי לשחרר את הצמתים תאים תאים כדי להשיג ביצועים לצמיחה טובה יותר של explants-vivo לשעבר. הנתונים שלנו מראים כי מספרים סלולריים מט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי נתמך בעיקר על ידי "לשאוף תוכנית Top אוניברסיטת" של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן, טייוואן (מענק ID-104R350144), כמו גם את משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (ID מענק: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). תודה מיוחדת במרכז לביוטכנולוגיה של הלאומית טייוואן אוניברסיטת למתן חדר חיה ומרחב מעבדה לחקר הנוכחי.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- . . alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
