Primær endodermal epithelial Cell Culture fra plommesekken membran av japanske Quail embryoer
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Vi har etablert en endodermal epitelial cellekulturmodell (EEC) for å studere funksjonen av visse enzymer og proteiner i mediering av næringsutnyttelse av avian embryo under utvikling. Befruktede japansk vaktel egg ble inkubert ved 37 ° C i 5 dager og deretter plommesekken membraner (YSM) ble samlet for å etablere EEC kultursystemet. Vi isolert embryonale endoderm lag fra YSM, og skiver membranen inn i 2 – 3 mm stykker og delvis fordøyd med kollagenase før seeding i 24-brønners kulturplater. Den EECS sprer ut av vevet og er klar for cellekulturstudier. Vi fant at den hadde EECS typiske kjennetegn ved YSM in vivo, for eksempel, akkumulering av lipid-dråper, ekspresjon av sterol O-acyltransferase og lipoprotein lipase. Den delvise fordøyelse behandling økt betydelig den vellykkede frekvensen av EEC kultur. Ved anvendelse av EECS, demonstrerte vi at ekspresjon av SOAT1 ble regulert av cAMP dependent protein kinase En beslektet veien. Denne primære japansk vaktel EEC kultur systemet er et nyttig verktøy for å studere embryonale lipid transport og å avklare rollen til gener som er involvert i formidling næringsutnyttelse i YSM under avian embryonal utvikling.
Introduction
Den store næringskilde av avian embryo er eggeplomme, som består av 33% lipider, 17% protein, og 1% aske. 1 Under embryoutvikling, plommesekken membran (YSM) vokser fra innenfor den embryoniske bukhulen og gradvis dekker eggeplomme flate. Begynnelsen på embryonale dag 2, genekspresjon assosiert med lipidmetabolisme og angiogenese gradvis økt i YSM, og YSM utvikler seg langsomt villus-lignende anslag. 8,9 Disse anslagene øke opptaket av plomme næringsstoffer for å støtte embryonal utvikling. Den YSM er en extraembryonic vev som inneholder tre bakterie lag, endoderm, mesoderm og ektoderm. 14 plommesekken ektoderm ansikter albumen og lenker med vitelline membran for å dekke forsiktig plommesekken. De endodermal epitelceller står overfor direkte mot eggeplomme og tjene som næringsutnyttelse portaler. 6 Som YSM utvides, endodermal epitelceller (EECS) kan deles med shape og funksjonalitet inn i to grupper, areal vitelline og området vasculosa. 7
Området vitelline består av endodermal celler og er fjernt fra fosteret; Området vasculosa består av mesodermal celler og dekker differensierte EECS med blodårer og bindevev. Ved embryonale dag 5 er plommen helt dekket av ektoderm og endoderm av YSM og vaskulær området har vokst raskt. Den YSM absorberer, lages på nytt og frigjør lipider (som eggeplomme-avledet meget lav tetthet lipoprotein) og proteiner i den embryoniske sirkulasjonssystemet. 9, 2 derfor etablert en primær japansk vaktel embryonal endodermal epitelial cellekultursystem, for å studere mekanismene for lipid utnyttelse i YSM under avian embryonal utvikling.
Lipider så som triacylglyserol, lecitin, fosfolipider og kolesterolester (CE) er de primære energikilder til avian embryo. På de tidlige stadier av utviklingen, plomme lipider er composed på bare 1,3% CE, og det stiger til 10-15% på mellomlang sikt av aviær embryoutvikling 3, 11. Kolesterol ester syntetiseres fra kolesterol av sterol O-acyltransferase 1 (SOAT1) i avian embryo YSM. 4
Lagring form av kolesterol er CE er CE gjennomført i lipoproteiner, og lipoproteiner transporteres med blodsirkulasjonen til vevet. 13 En uke før klekkes det er raske veksten av avian embryoer. Omtrent 68% av de gjenværende lipid innholdet i eggeplomme blir absorbert under dette trinn. 10 Mekanismen ved hvilken plomme lipider blir benyttet kan avklares av en EEC forskningsmodell. En kylling EEC kultur protokoll ble etablert for å oppnå denne forskningen målet. 2, 9 Men på grunn av den lave suksessrate på vev eksplantater, en forbedret EEC cellekultur prosedyre er nødvendig for å studere funksjonen av visse enzymer og proteiner i mediering av næringsutnyttelse avian embryoer under utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordi den foregående kultur systemet har kun begrenset suksess, er et bedre dyrkingssystem er nødvendig. Den japanske vaktel YSM endoderm krever behandling med proteolytiske enzymer som kollagenase å løsne celle-celle veikryss for å oppnå bedre vekst ytelse i ex-vivo explants. Våre data viser at celleantall fra en delvis spalting behandling var større enn fra ufordøyd vevskultur etter utsåing i 2 dager (figur 1). Derfor er det delvis proteolytisk fordøyelse et kritisk trinn for å forbedre ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Midler til utvikling av nåværende protokollen er spesielt støttet av "Aim for Top Universitetet Plan" av National Taiwan University, Taiwan (tilskudd ID-104R350144), samt departementet for vitenskap og teknologi i Taiwan (tilskudd ID: MOST 104 -2313-B-002-039-My3). Vi vil spesielt takke Senter for Bioteknologi av National Taiwan University for å gi en dyrerom og laboratorieplass for denne studien.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- . . alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
