Summary
Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine.
Abstract
La rapida proliferazione delle cellule, l'espressione tessuto-specifica di geni e la nascita di reti di segnalazione caratterizzano sviluppo embrionale precoce di tutti i vertebrati. La cinetica e la posizione dei segnali - anche all'interno di singole cellule - negli embrioni integra l'identificazione di importanti geni dello sviluppo. tecniche di immunoistochimica sono descritte che hanno dimostrato di definire la cinetica di segnali intracellulari animali e intere in strutture piccole come cilia primaria. Le tecniche per il fissaggio, di imaging e di elaborazione delle immagini utilizzando un microscopio a scansione laser confocale composto può essere completato in soli 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) è un organismo desiderabile per gli investigatori che cercano di condurre studi in una specie di vertebrati che è conveniente e rilevanti per le malattie umane. ko genetica o abbattimenti devono essere confermati dalla perdita del prodotto proteico reale. Tale conferma della perdita di proteinepuò essere realizzato utilizzando le tecniche descritte qui. Gli indizi in vie di segnalazione possono essere decifrati utilizzando anticorpi che sono reattivi con le proteine che sono stati post-traduzionali modificati dalla fosforilazione. Preservare e ottimizzare lo stato fosforilato di un epitopo è quindi fondamentale per questa determinazione e si realizza con questo protocollo.
Questo studio descrive tecniche per risolvere embrioni durante il primo 72 hr di sviluppo e co-localizzare una varietà di epitopi rilevanti con cilia nella zona di Kupffer Vesicle (KV), il rene e l'orecchio interno. Queste tecniche sono semplici, non richiedono la dissezione e può essere completato in un periodo relativamente breve di tempo. Proiezione pile di immagini confocale in una singola immagine è un mezzo utile per la presentazione di questi dati.
Protocol
Le procedure di zebrafish in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) alla Virginia Commonwealth University.
1. Preparazione dei reagenti
- 4% PFA / PBS. Pesare 8 g di paraformaldeide (PFA) nella cappa. Sempre nella cappa, sciogliere il asciutta PFA in ~ 80 ml di H 2 O distillata sotto agitazione e riscaldamento a 50 ° C. Mentre mescolando, aggiungere 3 - 10 gocce di fresca 1N NaOH fino PFA è completamente sciolto e la soluzione chiarisce. Togliere dal fuoco e aggiungere 100 ml di 2x tampone fosfato salino (PBS). Portare il volume a 200 ml con acqua distillata H 2 O. Raffreddare a RT e confermare pH di 7,4 prima dell'uso. Conservare al buio a 4 ° C ma utilizzare entro una settimana.
- Utilizzare 100% di metanolo senza supplementi. Utilizzare il 95% di etanolo senza supplementi.
- Preparare fosfato-tamponata Tween (PBT). Supplemento PBS (PBS) con 0,1% di Tween-20. Aggiungi 0.5 ml di Tween-20 soluzione madre 20% a 100 ml 1x PBS. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare fosfato-tamponata Triton-X (PBTx). Supplemento PBS con 0,1% Triton X-100. Aggiungere 0,5 ml di 20% Triton X-100 magazzino a 100 ml di PBS. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare 10% NGS / PBTx. blocchi normali siero di capra (NGS) non specifici siti di legame. NGS Conservare in aliquote a -20 ° C. Per utilizzare, aggiungere 1 ml a 9 ml PBTx.
- Preparare 50% glicerolo / PBS. Mescolare parti uguali di fondo 2x PBS e 100% glicerolo. Conservare a temperatura ambiente.
2. Embryo Fixation
- . (Es., Β-actina: CAAX-GFP) Allevamento ottenere wild type (AB e WIK) o transgenici embrioni attraverso accoppiamenti naturali. Se lo si desidera, iniettare embrioni con costrutti o morpholinos, come descritto. 15,16
- Sollevare embrioni. Raccogliere embrioni e incubare a 28,5 ° C in presenza di 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) per bloccare la pigmentazione come descritto. 17 p>
- Fissare. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato, 18, anestetizzare gli embrioni utilizzando MESAB, rimuovere l'acqua sistema quanto più possibile e aggiungere fresca 4% PFA / PBS per 3 - 4 ore a RT. NOTA: A volte meno di 20 ore dopo la fecondazione (HPF), fissare prima dechorionation. A volte dopo 20 HPF, dechorionate prima della fissazione con due coppie di pinze punta fine sotto un microscopio da dissezione.
- Cambiare soluzioni. Trasferire gli embrioni utilizzando una vasta pipetta foro, come descritto. 17 Variazione soluzioni in 1,5 ml con tappo provette da microcentrifuga, semplicemente permettendo embrioni di stabilirsi per gravità senza centrifugazione.
- Post-fissativo Dopo 3 -. 4 ore, rimuovere PFA / PBS, sostituire con il 100% di metanolo e conservare a -20 ° C per almeno 48 ore. NOTA: per la massima immunoreattività P-CaMK-II, limitare il tempo totale di memorizzazione metanolo per una settimana.
- Posizionare un minimo di 10 embrioni per ogni condizione sperimentale in innevate provetta da 1,5 ml microcentrifuga, ed etichettarli.
- Lasciare gli embrioni di stabilirsi. Rimuovere e scartare metanolo e reidratare con lavaggi progressive contenenti 0,5 ml di concentrazioni decrescenti di etanolo, come indicato nel passaggio successivo. Ogni passo è a 5 minuti di lavaggio con dondolo.
- Progressivamente reidratare con questi 5 soluzioni: 66% etanolo / 33% PBTx, 33% etanolo / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (questa è la prima ripetizione di PBTx), 100% PBTx (questa è la seconda ripetizione PBTx).
- Rimuovere ultimo lavaggio PBTx. Aggiungere 0,5 ml di 10% NGS / PBTx. Incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente con dolce dondolio e poi rimuovere ed eliminare soluzione.
- Preparare la soluzione anticorpo primario diluendo nel 10% NGS / PBTx. Se la co-immunostaining, usare degli anticorpi più alta affinità per primo. Per questo studio, incubare con il mouse anti-acetilata anticorpo monoclonale tubulina diluito 1: 500. per example, se ci sono 10 campioni, combinare 6 ml di soluzione madre di anticorpi con 3 ml di 10% NGS / PBTx quindi distribuire 0,3 ml di questa in ogni provetta.
- Aggiungere 0,2 - 0,5 ml di anticorpo primario diluito in ogni provetta per immergere tutti gli embrioni. Incubare con dolce dondolio O / N a temperatura ambiente.
- Al mattino, rimuovere ed eliminare soluzione di anticorpi. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx per lavare via anticorpo primario in eccesso. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte.
- Dim plafoniere e diluire l'anticorpo secondario fluorescente coniugato adeguato nel 10% NGS / PBTx in modo che ogni condizione contiene almeno 0,5 ml. Con il topo anti-acetilata anticorpo primario tubulina, utilizzare il verde-colorante fluorescente capra anti-IgG di topo ad una diluizione 1: 500.
- Incubare anticorpo secondario per 4 ore con leggera oscillazione a RT al buio. D'ora in poi, il processo di campioni sotto luci soffuse e incubare in un contenitore scuro o avvolgendo in un foglio di alluminio.
- Al termine dell'incubazione, rimuovere e scartare la soluzione di anticorpo secondario. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx per lavare. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte.
- Se la co-immunostaining, ottenere il secondo anticorpo primario da una specie diversa rispetto al primo anticorpo primario. In questi studi, seguire l'anticorpo CaMK-II di coniglio anti-fosfo dal colorante coniugato capra anti-coniglio anticorpo secondario rosso fluorescente IgG.
- Diluire coniglio anti-fosfo-CaMK II anticorpi 1:20. Per ogni tubo di embrioni, la sospensione in 0,3 ml di 10% NGS / PBTx, quindi aggiungere 15 ml di soluzione madre di anticorpi.
- Assicurarsi che gli embrioni sono immersi e le luci si abbassano. Incubare con dolce O dondolo / N a RT al buio.
- La mattina sotto le luci soffuse, rimuovere ed eliminare soluzione di anticorpi. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte.
- Mantenere plafoniere fioca e abbastanza del appropriata fluorescenza conju diluiregated anticorpo secondario in modo che ogni condizione contiene almeno 0,5 ml. In questo studio, diluire il colorante coniugato capra anti-IgG di coniglio anticorpi rosso fluorescente secondaria (canale rosso) 1: 500 nel 10% NGS / PBTx.
- Incubare secondo anticorpo secondario per 4 ore con leggera oscillazione a RT al buio.
- Alla fine di questa incubazione e sotto le luci soffuse, rimuovere ed eliminare la soluzione di anticorpo secondario. Aggiungere 0,5 ml PBTx. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte. Conservare in entrambi PBTx o il 50% glicerolo / PBS a seconda della procedura di imaging.
4. confocale Imaging and Processing
- Monte embrioni per l'imaging. Posizionare 1 - 5 embrioni su un vetrino. Creare una camera tra il vetrino principale e la diapositiva utilizzando frammenti coprioggetto su ciascun lato della camera. Tipicamente, quattro # 1 coprioggetto sono usati per fare queste pile distanziatori senza incollarsi.
NOTA: Nessun mezzo di montaggio è necessario. - Utilizzare una immersione in olio 100Xobiettivo di portare singolo embrione a fuoco con luce trasmessa. Spegnere la luce. Accendere microscopio confocale. Garantire che i laser appropriate (verde e / o rosso) sono accesi e accessary messa a fuoco remota è impegnata.
- Attivare il programma confocale. Nella "barra Acquisisci", selezionare l'obiettivo corretto. Nella barra "XY di base", impostare le dimensioni dell'immagine a 1.024 facendo clic sul pulsante 1.024.
- Nella "Laser e Detector" bar, clicca con il 488 box rosso e il verde 568 casella per attivare il laser e rivelatore per ciascun canale. Impostare pinhole a medio e regolare il guadagno nella barra "Gain" di ciascun canale da visualizzare.
- Nella barra "Acquisire Impostazioni", cliccare su "Live" per iniziare l'acquisizione di immagini. Nella barra "View Settings", deselezionare la casella "Forza integrale Zoom" al centro nella finestra "Live".
- Nella barra "Acquisisci impostazioni", nella scheda "Z", scorrere i livelli dell'immagine. Dopo aver selezionato il number di sezioni ottiche incorporare nella immagine, passare a un certo punto nel "centro" del piano z.
- Nella scheda "Z", fare clic sulla piccola scatola rossa "di riferimento". Questo azzererà la RFA nel punto prescelto come "centro". Nella casella "Step Size", selezionare lo spessore degli strati (tra 0,25 micron e 2,0 micron è l'ideale). Prestare attenzione alla casella "Formato File" e cercare di limitare a 1 GB.
NOTA: in genere, fino a 40 sezioni ottiche di 0,5 - 1,0 micron si ottengono, ma il numero di sezioni può essere determinato empiricamente. - Per trovare l'estremo superiore dell'immagine, fare clic sul cerchio accanto a "Top" e passare attraverso gli strati z. Ora clicca il cerchio accanto a "basso", il computer avrà l'immagine di nuovo al livello come il centro. Ancora spostarsi attraverso gli strati di trovare l'estremo inferiore dell'immagine.
- Clicca su "vivere" ancora una volta nei "Acquisisci Impostazioni" di dialogo per fermare il laseracquisizione. In questo pannello, selezionare le caselle rosse etichettati media e Z-stack. Queste scatole diventa verde.
- Nella casella "Acquisire Impostazioni", fai clic su "Single" per acquisire l'intera serie di immagini. È possibile monitorare lo stato di avanzamento, come la scansione in entrambi i canali e attraverso l'intero z-stack.
- Per risparmiare, fare clic sulla finestra del volume e fare clic su "Salva con nome" e il nome del file. Salvare come file ".ids". Per volume di rendere il file mentre lo z-stack è ancora aperto, selezionare i dati menu a discesa e clicca su "il volume di rendering". Salvare il file reso come un file TIFF. Questa è l'immagine proiettata che sono presenti in questa pubblicazione.
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Representative Results
Condizioni ottimali per la visualizzazione di fosfo-epitopi
I metodi che descrivono la immunolocalizzazione di epitopi della proteina negli embrioni di zebrafish sono state relativamente scarse rispetto a quelle per la localizzazione mRNA tramite ibridazione in situ. Fissativi utilizzati nella localizzazione epitopi di proteine nelle cellule ciliate di embrioni di zebrafish hanno incluso 4% PFA / PBS e fissativo di Dent, che è una miscela di metanolo e DMSO. 19 La localizzazione di RNA da montare tutto ibridazione in situ (WISH) è ottenuto in genere utilizzando PFA seguita da stoccaggio in 100% di metanolo. 20,21 I nostri studi hanno rivelato che la combinazione WISH fissativo, quando limitando il tempo in metanolo per due a sette giorni, è stato di gran lunga superiore a qualsiasi altro fissativo per immunolocalizzazione con l'anticorpo P-CaMK-II . Il segnale ottenuto con questa combinazione PFA / metanolo era also significativamente maggiore rispetto a quando fissativo di Dent, 4% PFA / PBS o metanolo sono stati usati da soli, a seconda del tempo di sviluppo e posizione all'interno dell'embrione.
Quando si ottimizza la tecnica qui e per ogni volta fissativo e sviluppo usato descritto, un campione di controllo è stato preparato in cui sono seguite tutte le fasi, ad eccezione che l'anticorpo primario è stato omesso. Tali campioni di controllo mancava un segnale fluorescente quando ripreso nelle stesse condizioni sopra descritte. Questo controllo è consigliato per altri investigatori replicare questo approccio con qualsiasi anticorpo.
La combinazione / metanolo fissativo PFA prodotto il più forte segnale P-CaMK-II ed è anche compatibile con immunocolorazione per tubulina acetilata, che è un marcatore standard per cilia. Punto di vista evolutivo, il primo organo ciliate che emerge ed è stato ripreso in questi studi è vescicola del Kupffer (KV). Il KV si trova all'estremità posteriore del notochord come mostrato nella fase 12-somite (15 HPF) (Figura 1). Il KV è un organo transitorio ed è responsabile di asimmetria sinistra-destra. Emerge a 2-somite stadio (12 HPF) e scompare attorno al palco 18-somite. Battere cilia primaria generare un flusso circolare di fluido, che porta ad un aumento di Ca2 + nelle cellule ciliate che rivestono il KV e l'attivazione di CaMK-II in posizioni discrete (Figura 1). Appare P-CaMK-II reattività e scompare su un lato del KV finché cilia battono. 12 In questa prima fase, i livelli totali embrionali CaMK-II sono ancora solo metà del livello al 24 HPF e un decimo del livello a 3 giorni di sviluppo. 11 Forse perché espressione totale CaMK-II è relativamente bassa a 15 HPF, alcun miglioramento nella tecnica immunocolorazione in questa fase è particolarmente importante.
betweit 24 e 72 HPF di sviluppo, P-CaMK-II appare sulla superficie apicale delle cellule ciliate che rivestono le regioni specifiche dei dotti pronephric (figure 2,3). L'immunoreattività del totale CaMK-II lungo l'intero condotto di pronephric e tutta somiti adiacenti (Figura 2) mostra che solo un sottoinsieme di embrionale CaMK-II è attivato (P-CaMK-II).
Le condizioni sono di fissazione coerente con il mantenimento GFP fluorescenza
Queste tecniche di fissaggio sono compatibili anche con conservando verde di fluorescenza proteina fluorescente (GFP) senza aumento (Figura 3). Nel CaMK-II GFP-tagged costrutto che viene utilizzato in questa figura, GFP mantiene fluorescenza sufficiente se PFA / metanolo fissazione e successiva immunocolorazione. In vista alto ingrandimento delle cellule che rivestono condotto pronephric (figura 3), the l'espressione mosaico di GFP-CaMK-II può essere visualizzato in cellule che sono state anche immunostained per P-CaMK-II.
L'orecchio embrionale zebrafish è un altro tessuto in cui l'elevazione di Ca 2+, agendo attraverso CaMK-II, influenza il suo sviluppo. 14 orecchie zebrafish appaiono normalmente a circa un giorno di sviluppo. In questo momento, CaMK-II è intensamente attivato alla base dei kinocilia ea livelli inferiori lungo il kinocilium (Figura 4). Questo insieme di immagini dimostra che questa tecnica di fissazione e immunolocalizzazione può rilevare la colorazione all'interno cilia, una struttura la cui sezione trasversale è inferiore a 1 micron. Queste ciglia mantengono la loro struttura nel corso di questo processo di fissazione e immunocolorazione.
Un ulteriore esempio di contrasto bicolore nell'orecchio interno in un secondo tempo di sviluppo è stato ottenuto mediante colorazione con entrambi Alexa 488phalloidin e tubulina anti-acetilati seguito da un Alexa 568 contrassegnati anticorpo secondario (Figura 5). È interessante notare che il metodo / metanolo fissazione PFA conserva sia F-actina e tubulina, che non è vero per tutti i fissativi. Questo esempio è mostrato uno a colori fusa per tutta orecchio e poi per sottoregioni. 14
Un ultimo esempio rappresentativo di contrasto bicolore è stato ottenuto con un ceppo di pesce che Embrioni prodotti con GFP membrana targeting (Figura 6). Membrana GFP mirati non è collegata a nessun altro proteine e si perde quando estratto con metanolo, quindi, questa immagine è stata ottenuta dal pesce che sono stati fissati con PFA solo. Questo risultato suggerisce che il trattamento metanolo estrae membrane, quindi non è raccomandato per proteine che possono essere membrana esclusivamente vincolati. Il segnale P-CaMK-II in questa figura è diminuita rispetto a quello ottenuto se metanoolo anche usato, ma questo dimostra che in questa fase e la posizione (rene) dello sviluppo dell'embrione, il segnale è abbastanza forte da essere rilevato senza trattamento metanolo. Questo non è vero in fase di KV,. Ad esempio, il metanolo è necessario per visualizzare i P-CaMK-II immunocolorazione. In questo esempio viene mostrato solo come immagine fusa in cui dotto pronephric del rene è adiacente al muscolo del tronco.
In sintesi, il / metanolo metodo di fissazione PFA qui descritto è compatibile con la conservazione della GFP e con colorazione per F-actina, tubulina acetilata, totale CaMK-II e P-CaMK-II.
Figura 1. P-CaMK-II contrastate per acetilato tubulina (cilia) in KV Zebrafish. Vista di un singolo Live Stage 12 somite (12 ss) embrione rivela la posizione posteriore del KV dal arrowhead (vista laterale, A) e il cerchio all'interno della scatola (vista ventrale, B). Embrioni in questa fase sono stati fissati con PFA / metanolo. Gli embrioni sono stati immunostained per tubulina acetilata seguito da un 488 anticorpo secondario marcati con Alexa (canale verde). Successivamente, il anticorpo policlonale di coniglio contro P-CaMK-II è stata seguita da un 568- anticorpo secondario marcato Alexa (canale rosso). Proiezioni di immagini fluorescenti due canali sono stati acquisiti come descritto ad ingrandimenti progressivamente crescenti (C, D). Barra di scala = 10 micron. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 12 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. P-CaMK-II contrastate perTotale CaMK-II lungo rene Zebrafish. Un singolo embrione dechorionated al 30 HPF è stato fissato usando PFA / metanolo. Gli embrioni sono stati poi colorate per totale CaMK-II seguito dal anticorpo secondario marcato Alexa 488 (verde). Successivamente, l'anticorpo primario P-CaMK-II è seguita l'anticorpo secondario marcato Alexa 568 (rosso). La colorazione rivela un arricchimento della attivata CaMK-II (in rosso) lungo la superficie apicale delle cellule che rivestono i dotti del rene zebrafish pronephric che la somma delle CaMK-II si arricchisce ai confini somite del tessuto muscolare adiacente e tutto sarcomeri. Barra di scala = 50 micron. Queste immagini sono state acquisite con un ingrandimento inferiore a quello descritto nel testo per visualizzare l'intero organo. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 13 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. P-CaMK-II contatore Imaged per GFP in cellule renali Zebrafish. Questo embrione 30 HPF è stato iniettato con un cDNA codificante un dominante negativo GFP-CaMK-II. 13 Tale inserimento mostrano tipicamente espressione mosaico. L'embrione è stato fissato usando PFA / metanolo e poi immunostained per P-CaMK-II utilizzando un Alexa 568 anticorpo secondario marcato. Imaging rivela che GFP persiste attraverso PFA / metanolo fissazione, reidratazione, il blocco e immunocolorazione. Barra di scala = 10 micron. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 13 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 P-CaMK-II di contrasto con acetilato tubulina in Ear Zebrafish interno. Questo embrione 30 HPF è stato fissato usando PFA / metanolo. L'anticorpo anti-acetilato tubulina è stato seguito in ordine dal anticorpo Alexa 488 -labeled secondaria, l'anticorpo P-CaMK-II e la Alexa 568 marcato anticorpo secondario. La colorazione rivela che P-CaMK-II è presente lungo le ciglia orecchio interno e co-localizza con tubulina acetilato. Barra di scala = 5 micron. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 14 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Actina e tubulina acetilato in Ear Zebrafish interno. Una tre giorni di età (72 HPF) zebrafish è stato fissato e immunostained per acetilata tubulin utilizzando Alexa 568 -labeled anticorpi secondari, seguita dalla visualizzazione di actina usando Alexa 488 falloidina. Cilia nonché innervazione assonale dell'orecchio è rivelato da tubulina acetilata (in rosso) e le strutture di F-actina includono fibre muscolari (in verde). Due regioni sensoriali ciliate dell'orecchio zebrafish sono mostrati in modo più dettagliato: la macula anteriore (mattino) e crista posteriore (PC). Barra di scala = 10 micron. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 14 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 6 P-CaMK-II contatore Imaged per membrana GFP nel rene Zebrafish Questa singola immagine unita in cui la β-actina:. CAAX-GFP embrione (30 HPF) è stato fissato e macchiato per P-CaMK-II seguito dal anticorpo secondario marcato Alexa 568. La colorazione rivela un arricchimento della attivata CaMK-II (in rosso) lungo la superficie apicale delle cellule che rivestono i dotti del rene zebrafish pronephric. Queste cellule duttali del rene sono immerso appena sotto il tessuto muscolare ed entrambi sono contrassegnati mediante l'espressione di membrana mirata GFP (in verde). Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo / metanolo PFA è stato sviluppato in questo laboratorio con l'obiettivo primario di ottimizzare la immunolocalizzazione del fosfo-T 287 -CaMK-II epitopi durante lo sviluppo zebrafish. Questo metodo localizzato successo P-CaMK-II durante la formazione di diversi organi ciliati compreso il KV zebrafish, 12 orecchio interno 14 e reni. 13 In particolare nella fase KV, questa tecnica era necessario. Il successo di questo metodo è probabilmente dovuto ad una combinazione di a) minimizzazione autofluorescenza, b) la conservazione dell'epitopo fosfo-CaMK-II e c) una migliore accessibilità dell'epitopo agli anticorpi.
Un limite principale di questo approccio è il tempo di stoccaggio in metanolo. Mentre immunoreattività di P-CaMK-II è massima dopo due giorni in metanolo a -20 ° C, la reattività di questo epitopo viene persa dopo una settimana di conservazione in metanolo. Non è chiaro se in questo momento il gruppo fosfato è hydrolyzed o ulteriori denaturazione si verifica che diminuisce immunoreattività. Metanolo / EGTA a -20 ° C è un fissativo tradizionalmente rapida per preservare strutture ricche di tubulina durante lo sviluppo di embrioni precoci. 22 Tuttavia, metanolo da solo non è auspicabile per conservare le strutture morfologia o anche come il citoscheletro actina e deve essere preceduto da PFA.
Ulteriori vantaggi di questo approccio sono che conserva anche altri epitopi come F-actina tubulina e acetilata e non elimina la fluorescenza nativa di GFP. Altri fissativi, come fissativo di Dent, sono superiori ad altri epitopi 13 e rimangono compatibile con P-CaMK-II colorazione, anche se P-CaMK-II colorazione è più debole di fissazione di Dent di PFA / metanolo. Dal momento che fosfo-proteine sono prevalenti in vie di segnalazione che sono attivi durante lo sviluppo precoce, fissativo di Dent e PFA / metanolo sono raccomandati come due fissativi per altri fosfo-epitopi in zebembrioni rafish. Nello sviluppo di applicazioni con questa tecnica per altre proteine e dei loro anticorpi, è stato utile avere anticorpi che sono anche reattivi su immunoblot e di aver clonato e le proteine con le quali gli anticorpi possono essere convalidati sovraespresso. 12
Vale la pena lo sforzo per ottimizzare le tecniche di immunolocalizzazione perché a) in grado di verificare la soppressione del gene a livello proteico e b) consente lo sviluppo di modelli di azione. In questo laboratorio, i risultati di questi test hanno permesso la formulazione di modelli attraverso cui funzioni CaMK-II. Ad esempio, la sua posizione nel KV è transitoria e asimmetrica, come il ruolo di questo organo. Nel rene, la sua posizione sul lato apicale delle cellule duttali pronephric suggerisce ruoli che rispondono ai segnali del condotto. Infine, l'attivazione di questo enzima in specifici puncta intenso alla base kinocilia orecchio suggerisce un segnale Ca 2+ localizzata. I metodi descritti quidovrebbe anche essere utile a qualsiasi investigatore che cerca di ottenere immagini ad alta risoluzione di qualsiasi tipo di cellula embrionale in due canali fluorescenti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Science Foundation IOS-0.817.658.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
| Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
| Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| anti-acetylated α-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
| anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
| anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
| Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
| Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
| Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1 ml tubes, store in freezer |
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10x stock solution or made in lab |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at RT |
| Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
| C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |
References
- Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
- Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
- Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
- Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
- Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
- Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
- Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
- Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
- Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
- Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
- Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
- Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
- Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
- Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).
