Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres

Sarah C. Rothschild; Ludmila Francescatto; Robert M. Tombes

doi:10.3791/53747

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Article de méthode

Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres

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DOI :

10.3791/53747

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19 février 2016

Sarah C. Rothschild¹ , Ludmila Francescatto² , Robert M. Tombes¹

¹Department of Biology, Virginia Commonwealth University, ²Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Techniques sont décrites à immunocoloration phospho-épitopes dans embryons de poisson zèbre entiers et ensuite procéder à deux couleurs confocal fluorescent localisation dans des structures cellulaires aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation et d'imagerie peuvent définir l'emplacement et de la cinétique de l'apparition ou de l'activation de protéines spécifiques.

Résumé

La prolifération rapide des cellules, l'expression tissu-spécifique des gènes et de l'émergence de réseaux de signalisation caractérisent le développement embryonnaire précoce de tous les vertébrés. La cinétique et l'emplacement des signaux - même à l'intérieur des cellules individuelles - dans l'embryon en développement complète l'identification des gènes du développement importants. immunocoloration techniques sont décrites qui ont été montré pour définir les cinétiques de signaux intracellulaires et des animaux entiers dans des structures aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation, d'imagerie et de traitement des images en utilisant un laser à balayage composé microscope confocal peut être complété en aussi peu que 36 heures.

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un organisme souhaitable pour les enquêteurs qui cherchent à mener des études dans une espèce de vertébré qui est abordable et pertinente à la maladie humaine. KO ou passes rabattues génétiques doivent être confirmées par la perte du produit protéique réelle. Cette confirmation de la perte de protéinespeut être réalisée en utilisant les techniques décrites ici. Des indices dans les voies de signalisation peuvent également être déchiffrés en utilisant des anticorps qui sont réactifs avec des protéines qui ont été modifiées après la traduction par phosphorylation. La préservation et l'optimisation de l'état phosphorylée d'un épitope est donc essentiel de cette détermination et est accompli par ce protocole.

Cette étude décrit les techniques pour fixer des embryons au cours des premières 72 heures de développement et de co-localiser une variété d'épitopes pertinents avec cils dans des vésicules (KV) de l'Kupffer, le rein et l'oreille interne. Ces techniques sont simples, ne nécessitent pas de dissection et peut être complété en une période relativement courte de temps. Projection des piles d'images confocale en une seule image est un moyen utile de présenter ces données.

Introduction

Les techniques décrites ici sont le résultat d’études qui ont cherché à définir des cibles en aval des signaux Ca²⁺lors d’événements qui se produisent au cours du développement précoce, y compris la fécondation, la gastrulation, la somitogenèse et la formation du tronc, de l’œil, du cerveau et des organes. ^1-3 Les découvertes initiales de la signalisation embryonnaire Ca²⁺ dépendaient de l’utilisation d’indicateurs Ca²⁺ naturels et modifiés, tels que l’aequorin⁴ et le fura-2. ⁵ Même avec la technologie actuelle, la détection d’élévations transitoires de Ca²⁺ nécessite des outils analytiques ....