Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken zur Charakterisierung verwendet Ende Reduktions (RE) und inneren Bereich Glycosyl-Sequenz (en) von Heteroxylane. De-gestärkten Weizen Endosperm Zellwände wurden als Alkohol unlösliche Rückstand (AIR) 1 und der Reihe nach mit Wasser (W-sol Fr) und 1 M KOH , die 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) extrahiert isoliert , wie von Ratnayake et beschrieben al. (2014) 2. Zwei verschiedene Ansätze (siehe Zusammenfassung in Abbildung 1) angenommen werden . In der ersten werden intakte W-sol AXs mit 2AB behandelt, um die ursprüngliche RE Hauptkette Zuckerrest zu markieren, und dann mit einem Endoxylanase behandelt, um eine Mischung aus 2AB-markiertem RE und inneren Bereich Reduktions Oligosaccharide zu erzeugen, respectively. In einem zweiten Ansatz wird die KOH-sol Fr mit Endoxylanase hydrolysiert, zuerst eine Mischung von Oligosacchariden zu erzeugen, die mit 2AB anschließend markiert sind. Die enzymatisch veröffentlicht ((un) markiert) Oligosaccharide aus beidenW- und KOH-sol Frs sind dann methyliert und die detaillierte Strukturanalyse sowohl die nativen und methylierte Oligosaccharide erfolgt eine Kombination von MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS und ESI-MS n verwenden. Endoxylanase verdaut KOH-sol AXs werden auch durch kernmagnetische Resonanz gekennzeichnet (NMR), die auch Informationen über die anomere Konfiguration liefert. Diese Techniken können auf andere Klassen von Polysacchariden angewendet werden, um die entsprechenden endo-Hydrolasen verwendet.
Introduction
Heteroxylane sind eine Familie von Polysacchariden , die die vorherrschenden nicht-cellulosischen Polysacchariden der Primärwänden von Gräsern und den sekundären Wänden aller Angiospermen 3-6 sind. Die Xylan – Backbones unterscheiden sich in ihren Typen und Muster der Substitution mit Glykosyl (Glucuronsäure (GlcA), Arabinose (Araf)) und nicht-Glycosyl (O-acetyl, Ferulasäure) -Reste je nach Gewebetyp, Entwicklungsstadium und Art 7.
Wände aus Weizen (Triticum aestivum L.) Endosperm bestehen hauptsächlich aus Arabinoxylane (AXs) (70%) und (1 → 3) (1 → 4) zusammengesetzt -β-D-Glucane (20%) mit geringen Mengen an Cellulose und heteromannans (je 2%) 8. Die Xylan-Rückgrat kann verschieden un-substituiert sein und überwiegend mono-substituierte (hauptsächlich O-2-Position und in einem geringeren Ausmaß O-3 Position) und di-substituierte (O-2 und O-3-Positionen) mit α-L-Ara f Reste 9. Das Reduktions Ende (RE) von heteroXylane aus dikotylen Pflanzen (beispielsweise Arabidopsis thaliana) 10 und Gymnospermen (beispielsweise Fichte (Picea abies)) 11 enthält eine charakteristische Tetrasaccharid Glycosyl – Sequenz; -β-D-Xyl p – (1 → 3) -α-L-Rha p – (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Um zu verstehen, heteroxylan Biosynthese und Funktion (biologische und Industrie), ist es wichtig, um vollständig die Xylan-Hauptsequenz die Typen und die Muster der Substitutionen sowie die Sequenz des reduzierenden Ende (RE) zu verstehen.
Spezifische Techniken zur strukturellen Charakterisierung von reduzierenden Ende (RE) und inneren Bereich Glycosyl-Sequenz (en) von Heteroxylane sind in diesem Manuskript beschrieben. Die Techniken beruhen auf Fluorophore (mit 2 Aminobenzamid (2AB)) das reduzierende Ende (RE) der heteroxylan Kette vor der enzymatischen (Endoxylanase) Hydrolyse Tagging. Dieser Ansatz, insbesondere für die RE Sequenzierung wurdezuerst vom Labor Yorker berichtet 10,12-13 aber jetzt sind der innere Bereich Sequenzierung erweitert und ist eine Kombination von etablierten Techniken, die für alle Heteroxylane unabhängig von ihrer Quelle der Isolation ebenso anpaßbar ist. Dieser Ansatz kann auch auf andere Klassen von Polysacchariden verwendet (soweit verfügbar) die entsprechenden endo-Hydrolasen angewendet werden.
In der vorliegenden Studie de-gestärkte wheat endosperm Zellwände wurden als ein in Alkohol unlösliche Rückstand (AIR) und der Reihe nach mit Wasser (W-sol Fr) und 1 M KOH , enthaltend 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) extrahiert wie beschrieben isoliert in Ratnayake et al. (2014) 2. Die freigesetzten Oligosaccharide von beiden W- und KOH-sol Frs dann methyliert und die detaillierte Strukturanalyse von sowohl den nativen und methylierte Oligosaccharide erfolgt mit einer Kombination von MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-Verbindung mit HPLC mit der Verwendung Online chromatographische Trennung einer RP C-18-Säule unter Verwendung vonund ESI-MS n. Endoxylanase verdaut KOH-sol AXs auch durch magnetische Kernresonanz (NMR) charakterisiert wurde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die meisten Matrixphase Zellwandpolysaccharide scheinbar zufällig haben Backbones substituierte (mit sowohl Glycosyl und nicht-Glycosyl – Reste) , die sehr variabel in Abhängigkeit von der Pflanzenart, Entwicklungsstadium und Gewebetyp 3 sind. Da Polysaccharide wird sekundären Genprodukten ihre Reihenfolge sind Vorlage nicht abgeleitet und es gibt daher keinen einzigen analytischen Ansatz, wie Nukleinsäuren und Proteinen besteht, für ihre Sequenzierung. Die Verfügbarkeit von gereinigten gestänge spezif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
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