Bu protokol, enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce RE'yi 2 aminobenzamid ile etiketleyerek ve ardından elde edilen oligosakkaritlerin kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak analiz edilmesiyle, heteroksilanların indirgeyici uç (RE) ve iç bölge glikosil dizi(ler)inin yapısal karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması
Bu makalede
Özet
Özet
Bu protokol, ucu (RE) ve heteroksi iç bölgesi glikosil sekans (lar) ı indirgenerek karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri tarif etmektedir. De-kolalı buğday endosperminin hücre duvarları, bir alkol-olmayan su (W-Sol FR) ile ekstre edilmiştir (AIR) 1 ve ardışık ve Ratnayake ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi, 1 M KOH% 1 NaBH4 (KOH-Sol FR) ihtiva eden izole edildi ark. (2014) 2. İki farklı yaklaşım (Şekil 1'de özet bakınız) kabul edilir. İlk olarak, sağlam B-Sol AXS, orijinal RE omurga zinciri şeker artığı etiketlemek için 2AB ile muamele edilir ve daha sonra 2AB etiketli Re ve sırasıyla oligosakaritler indirgeyici iç bölgeye bir karışımını oluşturmak için endoksilanazın ile muamele edilmiştir. İkinci bir yaklaşımda, KOH-sol Cu önce, daha sonra 2AB ile etiketlenir oligosakaritlerin karışımı oluşturmak için endoksilanazın ile hidrolize edilir. hem enzimatik serbest ((BM) etiketlendi) oligosakkaritlerW ve KOH'nin-Sol Frs MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS ve ESI-MS, n bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, sonra metil ve hem doğal hem de metillenmiş oligosakaritlerin ayrıntılı yapısal analizi bulunmaktadır. Endoksilanaz KOH-sol AXS ayrıca anomerik konfigürasyonu hakkında bilgiler sağlar, nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilir dijeste edilmiştir. Bu teknikler, uygun endo-hidrolazlar kullanan polisakkaritlerin diğer sınıflara uygulanabilir.
Giriş
Heteroksilanlar otların birincil duvar ve anjiyospermlerinde 3-6 ikincil duvar baskın selülozik olmayan polisakaritlerdir polisakaritlerin ailesidir. Ksilen omurgalar türlerine ve glikosil (glukuronik asit (GIcA), arabinoz (Araf)) ve non-glikosil (O-asetil, ferulik asit) ile doku tipi, gelişme aşaması ve türler 7 bağlı artıklar ile ikame farklılık gösteren.
Buğdaydan Duvarlar (Triticum aestivum L.) endosperm esas arabinoksilanlar (AXS) (% 70) ve (1 → 3) oluşmaktadır (1 → 4) -β-D-Glukanlan (% 20) selüloz ve heteromannans küçük miktarları ile (2 her biri%) 8. ksilen omurgaya ağırlıklı (esas olarak O....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
2-aminobenzamid W-sol axs Azaltılması sonu 1. Etiketleme (RE) Şeker Kalıntı (2AB)
- Fluoresan türevleri polisakarit omurga zincirlerinin indirgeyici uçları dönüştürmek için 65 ° C 'de 2 saat süre ile, 1 M NaBH3CN (sodyum siyanoborohidrid) (pH 5.5) varlığında, 2AB (0.2 M) W-Sol AXS inkübe edin.
DİKKAT: su ile temas halinde olduğunda, NaBH3CN zehirli siyanür gazı serbest aşağıdaki adımı davlumbaz yapılmalıdır.- NaBH3CN (62.8 mg), tartılır ve 1 M NaBH3CN çözeltisi hazırlamak için, su içinde bir mikrosantrifüj tüpü (1.5 mL) içinde (1 mi) çözülür. 65 ° C'de ısıtma ile 1 M NaBH3CN çözelt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
AXS 2AB etiketli RE oligosakaritlerin bir karışımını ve ksilan zinciri (Şekil 1, içi bölgelerden türetilen un etiketli (2AB etiketi olmadan) oligosakaritlerin bir dizi üreten B-Sol endoksilanaz sindirimi 2AB etiketli; adlı Ratnayake ve ark. 2). kromatografik yöntemlerin bir dizisi, daha sonra izomerler kompleks karışımının fraksiyonlanması kullanılır. Son olarak, MS teknikleri, daha sonra MS n tekniklerle dizilir izomerik yapılarının tespit.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çoğu matris faz hücre duvarı polisakkaritler görünüşte rastgele oldukça değişkendir bitki türlerinin, gelişim aşamasında ve doku tipi 3 bağlı (glikosil ve non-glikosil kalıntılar hem de) omurgaları ikame var. polisakaritler sekonder gen ürünleri olduğu sekans edilen şablon değildir ve nükleik asitler ve proteinler için var gibi tek bir analitik yaklaşımın dizileme için, bu nedenle bulunmaktadır. Saflaştırılmış bağlantı özgü hidrolitik enzimlerin mevcudiyeti daha sonra kromatografik olarak parçalara ayrılmış o.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.
Teşekkürler
Bu proje, Commonwealth Bilimsel ve Araştırma Örgütü Amiral Gemisi İşbirlikçi Araştırma Programı'ndan sağlanan fonlarla desteklenmiştir ve Food Futures Flagship aracılığıyla Yüksek Lifli Tahıl Kümesine sağlanmıştır. AB ayrıca, Avustralya Araştırma Konseyi'nin (ARC) ARC Bitki Hücre Duvarlarında Mükemmeliyet Merkezi'ne (CE110001007) verdiği desteği de kabul eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2 aminobenzamid (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodyum borohidrür (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Tehlikeli, dikkatli kullanın |
| sodyum siyanoborohidrit (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Tehlikeli, dikkatli kullanın |
| endo-1,4-β-Ksilanaz M1 (Trichoderma viride'den) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Döteryum Oksit (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Dondurarak kurutucu (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus sütunu | Agilent | (2.1&kez; 100 mm; 1.8 ve mikro; m boncuk boyutu) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Almanya) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - iyon tuzağı (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, Kaliforniya). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Almanya | ||
| Topspin (sürüm 3.0)-Biospin- yazılımı | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
Kaynaklar
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxyla....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
