Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Bu protokol, ucu (RE) ve heteroksi iç bölgesi glikosil sekans (lar) ı indirgenerek karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri tarif etmektedir. De-kolalı buğday endosperminin hücre duvarları, bir alkol-olmayan su (W-Sol FR) ile ekstre edilmiştir (AIR) 1 ve ardışık ve Ratnayake ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi, 1 M KOH% 1 NaBH4 (KOH-Sol FR) ihtiva eden izole edildi ark. (2014) 2. İki farklı yaklaşım (Şekil 1'de özet bakınız) kabul edilir. İlk olarak, sağlam B-Sol AXS, orijinal RE omurga zinciri şeker artığı etiketlemek için 2AB ile muamele edilir ve daha sonra 2AB etiketli Re ve sırasıyla oligosakaritler indirgeyici iç bölgeye bir karışımını oluşturmak için endoksilanazın ile muamele edilmiştir. İkinci bir yaklaşımda, KOH-sol Cu önce, daha sonra 2AB ile etiketlenir oligosakaritlerin karışımı oluşturmak için endoksilanazın ile hidrolize edilir. hem enzimatik serbest ((BM) etiketlendi) oligosakkaritlerW ve KOH'nin-Sol Frs MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS ve ESI-MS, n bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, sonra metil ve hem doğal hem de metillenmiş oligosakaritlerin ayrıntılı yapısal analizi bulunmaktadır. Endoksilanaz KOH-sol AXS ayrıca anomerik konfigürasyonu hakkında bilgiler sağlar, nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilir dijeste edilmiştir. Bu teknikler, uygun endo-hidrolazlar kullanan polisakkaritlerin diğer sınıflara uygulanabilir.
Introduction
Heteroksilanlar otların birincil duvar ve anjiyospermlerinde 3-6 ikincil duvar baskın selülozik olmayan polisakaritlerdir polisakaritlerin ailesidir. Ksilen omurgalar türlerine ve glikosil (glukuronik asit (GIcA), arabinoz (Araf)) ve non-glikosil (O-asetil, ferulik asit) ile doku tipi, gelişme aşaması ve türler 7 bağlı artıklar ile ikame farklılık gösteren.
Buğdaydan Duvarlar (Triticum aestivum L.) endosperm esas arabinoksilanlar (AXS) (% 70) ve (1 → 3) oluşmaktadır (1 → 4) -β-D-Glukanlan (% 20) selüloz ve heteromannans küçük miktarları ile (2 her biri%) 8. ksilen omurgaya ağırlıklı (esas olarak O-2 konumu ve daha az bir ölçüde o-3 konumu) ikame edilmiş mono ve di-ikame edilmiş α-L-Ara ile (O-2 ve O-3 pozisyonları) değişik un ikame edilmiş olabilir ve F kalıntıları 9. indirgeyici uç (RE) hetero(örneğin, Ladin (Picea Abies)) (örneğin, Arabidopsis thaliana) dikotlardan ksilanlar 10 ve jimnospermler 11 karakteristik bir tetrasakarit glikosil sekansı içerir, -β-D-xyl p – (1 → 3) -α-L-Rha p – (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-xyl s. heteroksilan biyosentezini ve fonksiyonunu (biyolojik ve endüstriyel) anlamak için, tam türleri ve değiştirmelerin modellerini yanı sıra indirgeyici ucunda (RE) dizisini anlamak için ksilen omurgaya sırası önemlidir.
ucu (RE) ve heteroksi iç bölgesi glikosil sekans (lar) ı indirgenerek yapısal karakterizasyon için kullanılan özel teknik, bu yazıda açıklanmıştır. teknikler enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce heteroksilan zincirinin indirgeyici ucunda (RE) (2 aminobenzamid (2AB)) ile etiketleme florofor kullanır. Özellikle RE dizileme için bu yaklaşım, olduİlk York laboratuvar 10,12-13 tarafından bildirilen ama şimdi izolasyon kaynağında bağımsız tüm heteroksi eşit uyarlanabilir kurulan tekniklerin bir arada iç bölge sıralama içerecek şekilde genişletilmiştir ve mesafesindedir. Bu yaklaşım, aynı zamanda (bulunan) uygun endo-hidrolazlar ile polisakaritlerin diğer sınıflara uygulanabilir.
Tarif edildiği gibi, bu çalışmada, de-kolalı buğday endosperminin hücre duvarları su (W-Sol FR) ile ekstre alkol çözülmeyen tortu (AIR) ve ardışık olarak izole edilmiş ve 1 M KOH% 1 NaBH4 (KOH-Sol FR) içeren edildi Ratnayake et al. (2014) 2. W- ve KOH'nin-Sol FRS hem serbest oligosakaritler HPLC ile ESI-QTOF-MS-bağlanmış MALDI-TOF-MS, bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, sonra metil ve hem doğal hem de metillenmiş oligosakaritlerin ayrıntılı yapısal analizi vardır bir RP C-18 kolonu kullanılarak çevrimiçi kromatografik ayırmave ESI-MS n. Endoksilanaz KOH-sol AXS, aynı zamanda nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilmiştir dijeste edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çoğu matris faz hücre duvarı polisakkaritler görünüşte rastgele oldukça değişkendir bitki türlerinin, gelişim aşamasında ve doku tipi 3 bağlı (glikosil ve non-glikosil kalıntılar hem de) omurgaları ikame var. polisakaritler sekonder gen ürünleri olduğu sekans edilen şablon değildir ve nükleik asitler ve proteinler için var gibi tek bir analitik yaklaşımın dizileme için, bu nedenle bulunmaktadır. Saflaştırılmış bağlantı özgü hidrolitik enzimlerin mevcudiyeti daha sonra …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A., Preiss, J. . The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. 14, 297-371 (1988).
- York, W. S., O’Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis – which end is up?. Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- . . Agilent MassHunter Workstation Software – Quantitative Analysis Familiarization Guide. , (2010).
- . . Topspin User Manual. , (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements —-4)[alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—- or —-4)[alpha- L-Araf-(1—-2)][alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—-. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
