Sekvensering av Plant Wall Heteroxylans Bruke enzymic, Chemical (Metylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Denne protokollen beskriver spesifikke teknikker som benyttes for karakterisering av reduserende ende (RE) og indre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans. De-stivede hvete endospermcelleveggene ble isolert som en alkohol-uoppløselig rest (AIR) en og i rekkefølge ble ekstrahert med vann (W-sol Fr) og 1 M KOH inneholdende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) som beskrevet av Ratnayake et al. (2014) 2. To ulike tilnærminger (se sammendrag i figur 1) er vedtatt. I den første, blir intakte W-sol AXS behandlet med 2AB å merke den opprinnelige RE stammekjeden sukkerrest og deretter behandlet med en endoxylanase for å generere en blanding av 2AB-merkede RE og indre område reduserende oligosakkarider, respektivt. I en annen tilnærming, er det KOH-sol Fr hydrolysert med endoxylanase først å generere en blanding av oligosakkarider som deretter merket med 2AB. De enzymatisk utgitt ((u) merket) oligosakkarider fra bådeW- og KOH-sol Frs blir deretter metylert og detaljert strukturell analyse av både de native og metylerte oligosakkarider utføres ved hjelp av en kombinasjon av MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS og ESI-MS n. Endoxylanase fordøyd KOH-sol AXS er også preget av kjernemagnetisk resonans (NMR) som også gir informasjon om det anomere konfigurasjon. Disse teknikkene kan anvendes for andre klasser av polysakkarider ved bruk av de passende endo-hydrolaser.
Introduction
Heteroxylans er en familie av polysakkarider som er de dominerende ikke-cellulose polysakkarider av de viktigste veggene av gress og de sekundære vegger av alle angiosperms 3-6. Xylanet hovedkjedene er forskjellige i deres typer og mønstre for substitusjon med glykosyl (glukoronsyre (GlcA), arabinose (Araf)) og ikke-glykosyl (O-acetyl, ferulsyre) rester avhengig av vevstype, utviklingsstadiet og arten 7.
Veggene fra hvete (Triticum aestivum L.) endosperm hovedsakelig består av arabinoxylaner (AXS) (70%) og (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glukan (20%) med mindre mengder av cellulose og heteromannans (2% hver) 8. Xylanet ryggraden kan være forskjellig un-substituerte og overveiende mono-substituert (i hovedsak o-2-posisjon og til en mindre grad O-3-stilling) og di-substituert (O-2 og O-3 posisjoner) med α-L-Ara f rester 9. Den reduserende ende (RE) av heteroxylans fra dicots (for eksempel Arabidopsis thaliana) 10 og gymnosperms (for eksempel gran (Picea abies)) 11 inneholder en karakteristisk tetrasakkarid glykosyl rekkefølge; -β-D-fortelle XYL p – (1 → 3) -α-L-Rha p – (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-fortelle XYL s. For å forstå heteroxylan biosyntese og funksjon (biologisk og nærings), er det viktig å fullt sekvensere xylan ryggrad for å forstå de typer og mønstre av substitusjoner, så vel som sekvensen av den reduserende enden (RE).
Spesifikke teknikker som brukes for strukturell karakterisering av reduserende ende (RE) og indre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans er beskrevet i dette manuskriptet. Teknikkene er avhengige av fluorofor merking (med 2-aminobenzamid (2AB)) den reduserende ende (RE) av heteroxylan kjeden før enzymatisk (endoxylanase) hydrolyse. Denne tilnærmingen, spesielt for RE sekvensering, bleførst rapportert av York laboratoriet 10,12-13, men er nå utvidet til å omfatte den innvendige region sekvensering og er en kombinasjon av etablerte teknikker som er like tilpasses alle heteroxylans uavhengig av deres kilde til isolasjon. Denne tilnærmingen kan også brukes til andre klasser av polysakkarider som bruker (hvor tilgjengelig) de aktuelle endo-hydrolaser.
I den foreliggende studien ble de-stivet hvete endospermcelleveggene isoleres som en alkohol-uoppløselig rest (AIR) og sekvensielt ekstrahert med vann (W-sol Fr) og 1 M KOH inneholdende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) som beskrevet i Ratnayake et al. (2014) 2. De frigitte oligosaccharider fra både W- og KOH-sol Frs blir deretter metylert og detaljert strukturell analyse av både de native og metylerte oligosakkarider utføres ved hjelp av en kombinasjon av MALDI-TOF-MS, ESI-MS QTOF-koblet med HPLC med online kromatografisk separasjon ved anvendelse av en RP C-18 kolonneog ESI-MS n. Endoxylanase spaltet KOH-sol AXS ble også karakterisert ved kjernemagnetisk resonans (NMR).
Protocol
Representative Results
Discussion
De fleste matrise fase cellevegg polysakkarider har tilsynelatende tilfeldig byttet stamnett (med både glykosyl og ikke-glykosylrester) som er svært variabel avhengig av plantearter, utviklingsstadiet og vevstype tre. Siden polysakkarider er sekundære genprodukter deres sekvens ikke er templat avledet og det er derfor ikke enkelt analytisk tilnærming, som for eksempel finnes for nukleinsyrer og proteiner, for deres sekvensering. Tilgjengeligheten av rensede koblings-spesifikk hydrolytiske enzymer har gitt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A., Preiss, J. . The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. 14, 297-371 (1988).
- York, W. S., O’Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis – which end is up?. Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- . . Agilent MassHunter Workstation Software – Quantitative Analysis Familiarization Guide. , (2010).
- . . Topspin User Manual. , (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements —-4)[alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—- or —-4)[alpha- L-Araf-(1—-2)][alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—-. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
