Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Dit protocol beschrijft de specifieke technieken die voor de karakterisering van reducerende einde (RE) en intern gebied glycosyl sequentie (s) van heteroxylans. De-gesteven tarwe endosperm celwanden werden geïsoleerd als alcohol-onoplosbare residu (AIR) 1 en achtereenvolgens geëxtraheerd met water (W-sol Fr) en 1 M KOH bevattende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) zoals beschreven door Ratnayake et al. (2014) 2. Twee verschillende benaderingen (zie overzicht in figuur 1) worden aangenomen. In de eerste, intact W-sol AXs behandeld met 2AB de oorspronkelijke RE hoofdketen suikerrest label en vervolgens behandeld met een endoxylanase aan een mengsel van gelabelde 2AB RE en intern gebied reducerende oligosacchariden, respectievelijk genereren. In een tweede benadering wordt de KOH-sol Fr gehydrolyseerd met endoxylanase eerst genereren van een mengsel van oligosacchariden die vervolgens gelabeld met 2AB. De enzymatisch vrijgegeven ((on) met het label) oligosacchariden uit beideW- en KOH-sol FR's vervolgens gemethyleerd en de gedetailleerde structurele analyse van zowel de natieve als gemethyleerde oligosacchariden wordt uitgevoerd met een combinatie van MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-MS-QTOF en ESI-MS n. Endoxylanase gedigereerd KOH-sol AXs worden ook gekenmerkt door kernmagnetische resonantie (NMR), die ook informatie over de anomere configuratie. Deze technieken kunnen worden toegepast op andere soorten polysacchariden met de juiste endo-hydrolasen.
Introduction
Heteroxylans zijn een familie van polysachariden die de overheersende cellulosevrije polysacchariden van de eerste wanden van grassen en de secundaire wanden van angiospermen 3-6 zijn. Xylaan ruggengraat verschillen in hun soorten en substitutiepatronen met glycosyl (glucuronzuur (GlcA), arabinose (Araf)) en niet-glycosyl (O-acetyl, ferulinezuur) residuen afhankelijk weefseltype, ontwikkelingsstadium en soorten 7.
Wanden van tarwe (Triticum aestivum L.) endosperm bestaan voornamelijk uit arabinoxylaan (AXs) (70%) en (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanen (20%) met kleine hoeveelheden cellulose en heteromannans (2% elk) 8. Xylaan backbone kan op verschillende niet-gesubstitueerde en overwegend mono-gesubstitueerde (voornamelijk O-2 positie en in mindere mate O-3) en met de digesubstitueerde (O-2 en O-3 posities) met α-L-Ara zijn f resten 9. Het reducerende einde (RE) van heteroxylanen van tweezaadlobbigen (bijvoorbeeld Arabidopsis thaliana) en 10 naaktzadigen (bijvoorbeeld spar (Picea abies)) 11 bevat een karakteristieke tetrasaccharide glycosyl sequentie; -β-D-Xyl p – (1 → 3) -α-L-Rha p – (1 → 2) -α-D-Gal A- p (1 → 4) -D-Xyl p. Om heteroxylan biosynthese en functie (biologische industrie) te begrijpen, is het belangrijk om volledige sequentie xylaan backbone op de soort en de patronen van substituties alsook de sequentie van het reducerende einde (RE) begrijpen.
Specifieke technieken die worden gebruikt voor de structurele karakterisering van reducerende einde (RE) en intern gebied glycosyl sequentie (s) van heteroxylans worden beschreven in dit manuscript. De betekenis berust op fluorofoor tagging (met 2 aminobenzamide (2AB)) het reducerende einde (RE) van de heteroxylan keten vóór enzymatische (endoxylanase) hydrolyse. Deze benadering, met name voor de RE sequencing waseerst gemeld door het laboratorium York 10,12-13 maar is nu uitgebreid met de interne regio sequentie omvatten en is een combinatie van bekende technieken die even aanpasbaar aan alle heteroxylans onafhankelijk van de bron van isolatie. Deze benadering kan ook worden toegepast op andere soorten polysacchariden gebruikt (indien beschikbaar) passende endo-hydrolasen.
In de onderhavige studie werden de gesteven tarwe endosperm celwanden geïsoleerd als een alcohol-onoplosbare residu (AIR) en achtereenvolgens geëxtraheerd met water (W-sol Fr) en 1M KOH bevattende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) zoals beschreven in Ratnayake et al. (2014) 2. De vrijgemaakte oligosacchariden zowel W- en KOH-sol FR's vervolgens gemethyleerd en de gedetailleerde structurele analyse van zowel de natieve als gemethyleerde oligosacchariden wordt uitgevoerd met een combinatie van MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-HPLC gekoppeld aan de online chromatografische scheiding onder toepassing van een RP C-18 kolomen ESI-MS n. Endoxylanase gedigereerd KOH-sol AXs ook gekenmerkt door kernmagnetische resonantie (NMR).
Protocol
Representative Results
Discussion
De meeste matrix fase celwandpolysacchariden hebben schijnbaar willekeurig vervangen backbones (met zowel glycosyl en non-glycosyl residuen) die zeer variabel zijn, afhankelijk van de plantensoort, ontwikkelingsstadium en weefseltype 3. Omdat polysachariden secundaire genproducten de sequentie niet template afgeleid en er dus geen enkele analytische benadering, zoals bekend van nucleïnezuren en eiwitten voor hun sequencing. De beschikbaarheid van gezuiverde linkage-specifieke hydrolytische enzymen verschaft …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A., Preiss, J. . The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. 14, 297-371 (1988).
- York, W. S., O’Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis – which end is up?. Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- . . Agilent MassHunter Workstation Software – Quantitative Analysis Familiarization Guide. , (2010).
- . . Topspin User Manual. , (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements —-4)[alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—- or —-4)[alpha- L-Araf-(1—-2)][alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—-. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
