Udviklingen af Frysetørret Loop-medierede Isotermiske Amplification reagenser til påvisning af<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii midlet forårsager Q-feber, er en obligat intracellulær bakterie. PCR diagnostiske assays er blevet udviklet til påvisning af C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver. PCR kræver specialiseret udstyr og omfattende uddannelse af slutbrugere, og derfor er det ikke egnet til rutinearbejde især i en ressource-begrænset område. Vi har udviklet en løkke-medieret isotermisk amplifikation (LAMP) assay til påvisning af tilstedeværelsen af C. burnetii i patientprøver. Denne fremgangsmåde udføres ved en enkelt temperatur omkring 60 ° C i et vandbad eller varmeblok. Følsomheden af denne LAMP assay er meget lig PCR med en detektionsgrænse på ca. 25 kopier pr reaktion. Denne rapport beskriver fremstillingen af reaktionen ved hjælp frysetørrede reagenser og visualisering af resultater ved hjælp hydroxynaphthol blå (HNB) eller en UV-lampe med fluorescerende interkalerende farvestof i reaktionen. Lampen reagenser var lyophilized og opbevaret ved stuetemperatur (RT) i en måned uden tab af detekteringsfølsomhed. Denne LAMP assay er særdeles robust, fordi reaktionsblandingen forberedelse ikke indebærer komplekse trin. Denne metode er ideel til brug i ressource-begrænsede indstillinger, hvor Q-feber er endemisk.
Introduction
Den lille gram-negativ bakterie Coxiella burnetii er det forårsagende agens for Q-feber, som er en verdensomspændende zoonose. På grund af Q-feber verdensomspændende distribution og den høje infektivitet af C. burnetii, amerikanske militært og civilt personel, der er udstationeret i udlandet er i fare for at blive smittet i endemiske områder.
Q-feber manifesterer sig i to former: akutte og kroniske infektioner. Akut Q-feber præsenterer sig med influenzalignende symptomer, hepatitis eller pneumoni og er sædvanligvis en selvbegrænsende sygdom med en lav dødelighed. Kronisk Q-feber, mens mindre udbredt, resulterer ofte i endocarditis, som har en meget højere dødelighed hvis venstre ubehandlet 1,2. Derfor er tidlig diagnose guide en passende behandling er afgørende for patientpleje. Polymerasekædereaktion (PCR) og kvantitativ real time PCR (qPCR) assays er blevet udviklet til påvisning af C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver 3-5 </ Sup>. Både PCR og qPCR er dyre og ofte ikke let tilgængelige i ressource-begrænset områder for rutinearbejde.
Oprindeligt beskrevet af Notomi 6, loop-medieret isotermiske forstærkning (LAMP) tilbyder et alternativ DNA-forstærkning metode. LAMP bruger Bst DNA-polymerase for strengdeplacering DNA-syntese sammen med specielt konstruerede primersæt, der genkender mindst seks uafhængige regioner af målgenet. Den væsentligste fordel ved LAMP er, at forstærkning sker under isotermiske betingelser. Derfor udgør kun et vandbad, varmeblok eller en inkubator påkrævet. Denne metode er blevet anvendt til at detektere flere rickettsial patogener 7-9. Visualisering af amplificerede DNA-produkter ved gelelektroforese er den mest nøjagtige metode, som kan differentiere ægte positive fra falske positiver grundet ikke-specifik amplifikation. Men de er involveret i gelelektroforese procedurer er ikke praktisk for ressource-begrænset areas. Flere alternative metoder blev udviklet for at detektere reaktionsprodukterne. Disse alternative, såsom turbiditet afledt af magnesiumpyrophosphat formationen 10 eller ved anvendelse af et fluorescerende interkalerende farvestof, der skal visualiseres under UV-lys 11,12 er gunstigere end køre en gel. Lampen reagenser var stabile i en måned, når den opbevares ved 25 ° C og 37 ° C, som er omgivelsestemperaturer i tropiske og subtropiske lande, hvor Q-feber er endemisk 13.
En LAMP-assay blev udviklet i vores laboratorium til påvisning af tilstedeværelsen af C. burnetii i plasmaprøver 14. Her beskriver vi en enkel protokol til udarbejdelse af LAMP reaktionsblandingen fra de frysetørrede reagenser. De lyofiliserede reagenser er stabil i en måned ved opbevaring ved stuetemperatur. Når det kombineres med en let visualisering metode, er dette en ideel metode til at bruge til påvisning C. burnetii i en ressource-begrænset indstilling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere udviklede vi en følsom og specifik LAMP assay rettet mod indsættelsen element IS1111a 14. Den IS1111 element blev valgt, fordi det er højt konserveret blandt forskellige stammer af C. burnetii og dets høje antal kopier (7. 110) i bakterier (Klee 2006). Vores resultater viste, at lampen kan detektere ca. 25 kopier af IS1111 element, som kan korrelere med så lidt som en kromosomal kopi af Coxiella DNA. I denne undersøgelse blev Bst DNA-polyme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Naval Medical Research Center, forskningsarbejde enhed 6000.RAD1.J.A0310. Synspunkterne i denne artikel er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis den officielle politik eller placeringen af Institut for søværnet, Department of Defense, eller den amerikanske regering. Wei Mei Ching er ansat af den amerikanske regering. Dette arbejde blev fremstillet som en del af hendes officielle pligter. Afsnit 17 USC § 105. at »Ophavsretlig beskyttelse efter denne titel er ikke tilgængelig for noget arbejde af den amerikanske regering.« Afsnit 17 USC §101 definerer en amerikanske regering arbejde som arbejde, udarbejdet af værnepligt medlem eller ansat af den amerikanske regering som en del af denne persons officielle pligter.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
