O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em> Burnetii Coxiella</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q, é uma bactéria intracelular obrigatório. Ensaios de diagnóstico baseado em PCR, têm sido desenvolvidos para a detecção de C. ADN burnetii em culturas de células e amostras clínicas. PCR exige equipamento especializado e treinamento extensivo usuário final e, portanto, não é adequado para o trabalho de rotina, especialmente em uma área de recursos limitados. Nós desenvolvemos um ensaio de amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP) para detectar a presença de C. burnetii em amostras de doentes. Este método é realizado em uma única temperatura de cerca de 60 ° C em um banho-maria ou bloco de aquecimento. A sensibilidade deste ensaio de LAMP é muito semelhante a PCR com um limite de detecção de cerca de 25 cópias por reacção. Este relatório descreve a preparação de reacção, utilizando reagentes liofilizados e visualização dos resultados utilizando azul hydroxynaphthol (HNB) ou uma lâmpada de UV com corante fluorescente intercalante na reacção. Os reagentes LAMP foram lyophilized e armazenado à temperatura ambiente (TA) durante um mês sem perda de sensibilidade de detecção. Este ensaio LAMP é particularmente robusto, porque a preparação da mistura de reacção não envolve etapas complexas. Este método é ideal para uso em ambientes de recursos limitados onde a febre Q é endêmica.
Introduction
A pequena bactéria gram-negativa Coxiella burnetii é o agente causador da febre Q, que é uma zoonose em todo o mundo. Devido à distribuição mundial da febre Q ea alta infectividade do C. burnetii, pessoal militar e civil dos Estados Unidos desdobradas no exterior estão em risco de serem infectados nas áreas endêmicas.
febre Q manifesta de duas formas: infecções agudas e crónicas. Febre Q aguda apresenta-se com sintomas semelhantes aos da gripe, hepatite ou pneumonia, e geralmente é uma doença autolimitada, com uma taxa de mortalidade baixa. Febre Q crónica, embora menos prevalente, muitas vezes resulta em endocardite, que tem uma taxa de mortalidade muito maior se não tratada 1,2. Portanto, o diagnóstico precoce para orientar um tratamento adequado é fundamental para o atendimento ao paciente. Reacção em cadeia da polimerase (PCR) e PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ensaios foram desenvolvidos para a detecção de C. DNA burnetii em culturas de células e amostras clínicas 3-5 </ Sup>. Ambos PCR e qPCR são caros e muitas vezes não é facilmente disponível em áreas com recursos limitados para o trabalho de rotina.
Originalmente descrito por Notomi 6, amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) oferece um método de amplificação de DNA alternativa. LAMP utiliza ADN-polimerase Bst ADN para a síntese de deslocamento de cadeia, juntamente com conjuntos de iniciadores especialmente concebidos para que reconhecem, pelo menos, seis regiões independentes do gene alvo. A vantagem mais significativa de LAMP é que a amplificação ocorre sob condições isotérmicas. Por conseguinte, apenas um banho de água, ou um bloco de aquecimento da incubadora é necessária. Este método tem sido utilizado para detectar vários agentes patogénicos rickettsiais 7-9. A visualização dos produtos de ADN amplificados por electroforese em gel é o método mais preciso que pode diferenciar a partir de verdadeiros positivos falsos positivos devido à amplificação não específica. No entanto, os procedimentos envolvidos na electroforese em gel não são práticos para ar de recursos limitadoseas. Vários métodos alternativos foram desenvolvidos para detectar os produtos de reacção. Estes alternativa, tal como turbidez derivado de pirofosfato de magnésio formação 10 ou utilizando um corante fluorescente intercalante a ser visualizado sob luz UV 11,12 são mais favoráveis do que a execução de um gel. Os reagentes LAMP foram estáveis durante um mês quando armazenada a 25 ° C e 37 ° C, que são temperatura ambiente em países tropicais e sub-tropicais onde a febre Q é endémica 13.
Um ensaio de LAMP foi desenvolvido no nosso laboratório para detectar a presença de C. burnetii em amostras de plasma 14. Descrevemos aqui um protocolo simples para a preparação da mistura de reacção a partir de LAMP os reagentes liofilizados. Os reagentes liofilizados são estáveis durante um mês quando armazenada à temperatura ambiente. Quando combinado com um método fácil visualização, este é um método ideal para utilizar para a detecção de C. burnetii em um ambiente de recursos limitados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anteriormente, foi desenvolvido um ensaio LAMP sensível e específico visando o elemento de inserção IS1111a 14. O elemento IS1111 foi selecionado porque ele é altamente conservado entre as diferentes estirpes de C. burnetii e o seu elevado número de cópias (7-110) em que as bactérias (Klee 2006). Os nossos resultados mostraram que a lâmpada pode detectar cerca de 25 cópias do elemento IS1111, que pode correlacionar-se com tão pouco como uma única cópia cromoss?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela Naval Medical Research Center, a pesquisa unidade de trabalho 6000.RAD1.J.A0310. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não reflecte necessariamente a política oficial ou a posição do Departamento da Marinha, Departamento de Defesa, ou do Governo dos Estados Unidos. Wei-Mei Ching é um funcionário do governo dos EUA. Este trabalho foi preparado como parte de seus deveres oficiais. Título 17 USC §105 prevê que «proteção dos direitos autorais sob este título não está disponível para qualquer obra do Governo dos Estados Unidos. ' Título 17 USC §101 define uma obra governo dos Estados Unidos como um trabalho preparado pelo membro do serviço militar ou funcionário do governo dos EUA como parte de suas funções oficiais dessa pessoa.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
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